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摘要:氧化石墨烯(GO)具有独特的DNA吸附性能和可作为通用型荧光淬灭剂的性质，从而在生物分子的检测中得到广泛应用。基于GO的光学传感器依据这样的原理：GO能强烈吸附荧光染料标记的单链DNA同时淬灭其荧光；目标物与荧光单链DNA结合使其构象转变，进而使荧光染料与GO距离拉大，荧光恢复，从而实现对目标物的检测。本实验利用GO对单双链DNA结合力大小的差别和Lambda核酸外切酶酶切DNA底物的选择性，构建了一个简便快速的荧光传感方法检测碱性磷酸酶的活性，并对酶抑制剂的影响做了考察。9811
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关键词: 氧化石墨烯；碱性磷酸酶；Lambda核酸外切酶
Fluorescence Assay of Alkaline Phosphatase Activity Based on Graphene Oxide Coupled with Exonuclease Reaction
Abstract: Owing to the unique property of DNA adsorption and being a universal fluorescence quencher, graphene oxide (GO) has found a wide application in biomolecular detection. The GO-based optical sensors all rely on the principle that GO can absorb the dye-labeled single-stranded DNA(ssDNA) and quench its fluorescence; The binding of target with dye-labeled ssDNA leads to its conformational transition and widen the distance between dye and GO, followed by the fluorescence recovery and the realization of target detection. In this paper, we constructed a rapid, convenient fluorescent biosensor for assay of alkaline phosphatase (AP) activity based on the fact that GO shows different binding affinity for dsDNA and ssDNA and Lambda exonuclease (λ exo) has a selectivity for its DNA substrate. Besides, this paper also investigated the inhibition effect of the inhibitor.
Key Words: Graphene oxide (GO); alkaline phosphatase (ALP); Lambda exonuclease (λ exo)
目 录
摘 要 1
引 言 1
1 实验部分 3
1.1 仪器 3
1.2 药品与试剂 3
1.3 实验步骤 4
2 结果与讨论 4
2.1实验原理与探针设计 4
2.2 实验原理验证 5
2.3 实验条件优化 5
2.4 传感器的检测性能 6
2.5 抑制剂抑制效果的考察 7
3结 论 8
参考文献 9
致 谢 11
引 言
磷酸酶(AP)是一种广泛应用于临床分析的酶，它能对一系列含有磷酸类化合物的大量底物的水解反应起催化作用，因此在许多疾病的诊断中常被用作酶联免疫吸附测定(ELISA)[1]的标志物。当肾脏、肠或胎盘损害时会出现骨骼系统的疾病，例如佩吉特病、骨软化症、骨折和恶性肿瘤，还可能会导致血清中的AP增加。因此，许多诊断和临床试验需要检测到的AP的灵敏度和选择性非常高。碱性磷酸酶（ALP）活性的测定十分重要，特别是在诊断技术上，ALP活性测定的新方法不断在文献中被引用。高浓度的血清ALP通常与骨代谢疾病，如佩吉特氏病[2]、骨肉瘤和软骨病有关，它还可作为其它一些疾病，如卵巢肿瘤、肝脏异常、艾滋病、细菌感染和白血病的原发性或继发性标志物[3]。由于ALP反应基本上都是不受干扰的，且ALP本身是高度稳定的并具有较高的周转率，故常作为免疫示，广泛使用在分子生物学中。作为催化蛋白、核酸或者小分子去磷酸化过程中一个重要的蛋白酶，ALP存在于各种组织中[4]。它是一种分布广泛的膜结合酶，具有较大的底物特异性，可以在体内外催化水解各种磷酸化的底物[5]。在不同的组织中，通过对不同的天然底物去磷酸化，ALP表现出不同的作用，从而使ALP的表达水平与多种疾病相关，如无动力性骨病、肝炎和前列腺癌等[6,7]。此外，文献还报道ALP与很多其他酶具有同源性，表现出一些相同的催化性能和底物特异性[8]。又由于ALP在人体各脏器器官中分布广泛，因此对碱性磷酸酶的检测意义重大。检测ALP的传统方法有吸收分光光度法[9]、免疫测定法[10]、基态同位素32P标记法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和射线自显迹法[11,12]等。但是，上述方法有的步骤繁琐，所用仪器昂贵，有的灵敏度有限，选择性差。甚至有些方法还需同位素标记，限制了它们的广泛应用。因此，发展简便价廉的检测碱性磷酸酶的新方法十分必要。
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