荧光分析法由于具有操作简单、有较高的灵敏度和选择性、检测限低、不破坏样品和易于实现在线检测等特点，在生物体内各种活性物种检测中得到了广泛应用。近年来，双光子荧光探针技术在生命科学、医学诊断、信息科学等领域中的使用正在逐渐增多，这是因为双光子荧光探针技术比单光子荧光探针技术有更多的优点，例如近红外光激发、对生物样品穿透深度大、自发荧光低、光毒性小、对细胞和组织损伤小、漂白区域小、能够延长活细胞和组织的观测时间等，为生命科学的研究提供了更为锐利的工具。本篇文章主要介绍了有机双光子吸收的基本原理和有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的研究现状，同时对有机线粒体内活性小分子荧光探针未来的发展趋势进行了展望。

1 双光子吸收基本原理及优势

单光子吸收是指利用紫外或可见光激发荧光分子时，只有吸收光子的能量与荧光分子的基态和激发态之间的能带隙相匹配时才会发生电子跃迁。双光子吸收现象由Göppert-Mayer[7]于1931年首次提出，60年代初激光器出现后，Kaiser等[8]利用红宝石激光器为激发光源，首先从实验上证实了双光子吸收过程。双光子吸收是指物质分子在脉冲激光等强光的激发下，在较短的时间内，同时或先后吸收两个相同或者不同频率的光子，物质分子中的电子由基态通过一个中间虚拟态(virtual state)直接吸收两个光子跃迁至一个较高能态的过程。双光子吸收过程完全不同于单光子吸收过程，而是荧光团与激发光相互作用的过程，其单、双光子吸收过程如图1所示。在双光子吸收过程中，物质分子的吸收强度、电子跃迁几率与激发光强度的平方成正比；双光子吸收发生在焦点处λ3(λ为激发波长)的空间范围内，而单光子吸收发生在整个聚焦光路范围内。因此，双光子吸收激发光穿透作用强，瑞利散射小，具有更高的空间分辨率和选择性；减少了对被测生物标本样品的光致毒性以及对荧光的光漂白，增加了有效观测时间；双光子技术在信息、材料、生物荧光识别、医学荧光诊断等领域具有较高的应用价值[7-13]。

图1 单、双光子吸收和发射示意图

2 有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针研究现状

目前用于活细胞线粒体特异性荧光成像的荧光探针主要有两种，一种是商品化线粒体荧光探针；另一种是具有与线粒体定位功能的亲脂性的阳离子基团。商品化线粒体荧光探针主要有两大类：一类是罗丹明类，另一类是菁染料，如MitoTracker Green/Red/Deep Red FM系列。三苯基季磷盐是一种高效的线粒体定位阳离子基团，具有较强的疏水性，连接在活性小分子荧光团上可实现对细胞中线粒体内活性物质的检测和荧光成像。研究人员将对细胞内活性小分子或金属离子具有识别作用的荧光基团与具有线粒体靶向作用的亲脂性阳离子相连接，以实现对线粒体内这些物质的检测与成像。迄今为止报道的大部分有机线粒体内活性小分子荧光探针均为单光子荧光探针，虽然这些探针也能用双光子进行激发，但其双光子吸收截面小，荧光量子产率较低，还存在背景干扰大、光稳定性差、毒性大、选择性差、斯托克斯(Stokes)位移小等缺点。而对于有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的报道则相对较少，对其生物学机制的研究尚不够深入，其研究也刚刚起步。下面就近年来有机双光子线粒体内活性小分子荧光探针的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针未来的发展趋势。

2。1有机线粒体小分子荧光探针

线粒体不仅是细胞的能量工厂，而且是细胞生存与死亡的调控中心、与细胞凋亡、氧自由基产生、心血管病、神经性疾病、机体衰老、癌症等疾病密切相关。因此，构建性能优越，且能全面、准确检测细胞内线粒体的荧光探针对于研究线粒体内复杂的生物学过程具有重要的科学意义。2013年Zhang等[14]以氟化硼络合二吡咯甲川类染料(BODIPY)为母体，开发了一种不受膜电位干扰的能够准确定位线粒体的荧光探针1(图2)，能够实现活细胞内线粒体的单光子荧光成像，是一例非常优质的线粒体定位染料。2014年Miao等[15]以咔唑为母体环结构设计合成了1对定位活细胞内线粒体的双光子荧光探针2和3(图2)。这对探针具有较大的双光子活性吸收截面和Stokes位移、良好的膜透性、较长的保留时间、较高的光稳定性以及优异的复染相容性等特性，是一类有较好应用价值的双光子线粒体荧光探针。2014年Dai等[16]以萘二甲酰亚胺为母体环结构，三苯基季磷盐阳离子为识别基团，设计合成了一个双光子线粒体荧光探针4(图2)。该探针透膜性好、选择性好、对线粒体极性敏感，实现了活细胞内线粒体的双光子光子荧光成像，有望发展成为一种新型的检测线粒体微环境变化的双光子荧光探针。