摘  要：本文基于核酸G-四链体结构特异性结合荧光染料NMM使其荧光增强的原理，并以此做荧光报告基团，用于DNA聚合酶的非标记检测。在DNA聚合酶的诱导作用下，DNA发夹引物（HP）能够发生聚合延伸反应，从而生成双链DNA产物，将G-四链体序列封闭起来。无聚合酶时，嵌入的荧光染料NMM能够结合HP上自由的G-四链体结构，使得荧光信号显著地增强，进而检测DNA聚合酶的活性。该方法不仅便捷灵敏、信噪比高，而且不需要设计复杂的DNA序列，可用于实时检测DNA聚合酶活性。82810

毕业论文关键词：G-四链体；DNA发夹引物；DNA聚合酶；荧光染料

G-quadruplex-based DNA Hairpin Probe for Label-free Fluorescent Detection of DNA Polymerase

Abstract: This paper is based on the principal that G-quadruplex structure can specifically binds with fluorescent dye NMM, results in significant fluorescence enhancement。 Taking it as the fluorescent report, one can achieve the label free detection of DNA polymerase activity。 DNA polymerase induces the polymerization of DNA hairpin primer (HP) and generates double-stranded DNA extension product, blocking the G-quadruplex sequences。 Without DNA polymerase, the free G-quadruplex sequences on HP binds with NMM followed by fluorescence enhancement, then realizing the label free assay for DNA polymerase activity。 This proposed method is fast, sensitive and low cost, avoiding complex sequence design, which can be applied in the real-time detection of DNA polymerase activity。

Key Words: G-quadruplex; DNA hairpin primer; DNA polymerase; Fluorescent dyes

目    录

摘  要 1

引  言 1

1 实验部分 3

1。1 实验仪器 3

1。2 实验药品和试剂 3

1。3 实验步骤 4

2 结果与讨论 4

2。1 实验原理与DNA探针设计 4

2。2 实验原理验证 5

2。3 实验条件考察 6

2。4 DNA聚合酶活性的检测性能 7

3 结  论 8

参考文献 9

致  谢 11

发夹型G-四链体探针用于DNA聚合酶的非标记荧光检测

引 言

DNA聚合酶可以以单链DNA为复制模板，在催化底物dNTPs的作用下，将单链DNA由5'端点开始复制到3'端，从而合成双链DNA结构。1957年，美国科学家科恩伯格第一次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶。近年来，随着科学技术的发展和研究范围的扩大，人们发现DNA聚合酶不仅存在微生物中，在很多其它的原核生物中也存在。到目前为止，DNA聚合酶的有关基因被人类测序和克隆的种类已经高达100多种[1]。聚合酶在基因修复、基因复制、细胞周期调控和肿瘤的发生中起重要作用。聚合酶是染色体中最重要的复制酶，它参与了多种细胞损伤修复，对保证基因组结构和遗传的稳定性具有重要意义。由于其重要的生物学功能，目前DNA聚合酶被应用于基因测序、基因克隆及载体制备等各种生物分子学技术中[2]。如今，DNA聚合酶已经成为诊断肿瘤疾病和观察疾病疗效的有效方法[3]，在诊断肿瘤和观察治疗效果方面，DNA聚合酶的活性检测具有非常重大的意义[4]。多种疾病药物研究开发工程已将DNA聚合酶作为重要靶标[5,6]和肿瘤标记物。早期研究DNA聚合酶的方法主要是放射性同位素标记结合凝胶电泳[7]。这些方法浪费时间和精力，并且含有放射性物质，对人体和环境产生极大的危害。时代的脚步不断加快，越来越多的非放射性的DNA聚合酶检测方法不断的发展起来，这些方法虽然具有操作便捷、通用性好、响应速度快等优点，但是仍有一些缺点。比如PCR法[8,9]不能很好地分析不耐高温的聚合酶的活性；Brakmann等发展的dNTP法[10]和Summerer等报道的标记ONs的分子信标法[11]需要对底物进行荧光标记，所需的实验成本相当高；Tveit[12]提出的应用DNA染料Picogreen来检测DNA聚合酶活性的方法不需要荧光标记的底物，但是染料成本高，且没有办法提供实时、动态的聚合过程和酶活性信息。因此，开辟一个拥有灵敏度高、特异性好和低成本等优点的聚合酶活性检测新方法的新时代势在必行[13]。文献综述