海藻糖生产菌株的诱变筛选(2)
研究运用先进的生化分离技术提高得率和纯度，对于降低生产成本，促进推广应用很重要。日本从发酵液中提取海藻糖，提取率可达到88.6%，同时纯度达到99.5%。国内冯朴荪等解决了限制海藻糖提取率的关键问题，得到高纯度晶体。而采用纯水提取法应用于工业生产还有一定困难，酵母悬液黏度过大等问题仍难以解决。
1.1.2 酶转化法生产
微生物可以由葡萄糖、麦芽糖、寡糖、淀粉生物合成海藻糖，并分别由不同的酶催化合成，到目前为止，发现的有应用价值，适合工业化生产的酶是：
(1) 海藻糖合酶和水生栖热菌的海藻糖合酶
相对分子质量等电点最适为，最适反应温度间酶稳定。在保温酶稳定，在合成率。该酶热稳定性好，有利于酶的保存，在较高温度反应可防止杂菌污染，而且反应简单，底物麦芽糖价格便宜，适合于工业化生产。
(2) 麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖基水解酶
在节杆菌中的这两种酶联合作用以直链淀粉为底物，海藻糖收率可达以上，的底物特异性是，麦芽糖不能作底物，对麦芽三糖作用较差，对麦芽三糖以上的麦芽寡糖都可以作用。
(3) 新型葡萄糖转移酶和α-淀粉酶
在硫矿硫化叶菌中发现这两个酶联合作用于淀粉，用淀粉经普鲁兰酶脱支后做底物海藻糖收率达81.5%。新型葡萄糖基转移酶相对分子量76，等电点为6.1，在pH5.0-6.0和70℃-80℃活力最高，在85℃保温6h仍有91%酶活力。另一个酶是一种新型α-淀粉酶，不同与一般α-淀粉酶，对葡萄糖基海藻糖的特异性强，相对分子质量61，在pH4.5-5.5,75-85℃保温6h保留100%。这两种酶热稳定性很好，而且淀粉价格便宜，可望成为海藻糖工业生产的新途径。目前这两个酶的基因已克隆、表达，基因工程菌株可以在常温培养，产酶活力高，有工业应用前景。
1.1.3 利用工程微生物和转基因植物生产海藻糖
基因工程技术为了研制海藻糖开辟了一条新途径。美国Calgene公司与英国Quadrant公司合作，研究利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产海藻糖[2]。除了“工程微生物”生产海藻糖以外，利用转基因植物生产海藻糖的研究在国外也颇为活跃，荷兰植物生物技术公司将大肠杆菌的海藻糖合酶基因导入甜菜、马铃薯中，获得大量廉价海藻糖。
1.1.4 发酵法生产海藻糖
西北大学生命科学学院的李红民教授在2001年采用He-Ne激光对面包酵母菌进行诱变处理[3],筛选到3株低糖面团起发活力大幅度提高的菌株XD198、XD193和XD174,其低糖面团起发活力比出发菌株分别提高31.3%、32.7%和35.3%。海藻糖含量分别较出发菌株提高-1.37%、10.83%、5.10%。而且筛选到的高活力菌株遗传性能稳定。证明激光诱变效果明显,是进行面包酵母菌种选育的理想方法之一。
山东大学微生物技术国家重点实验室的张厚程，刘娟，池振明等从以前的研究曾发现扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligerasdu) 能利用可溶性淀粉发酵累积质量浓度为180g/L的海藻糖[4]。然而,该菌株含有高活性的酸性和中性海藻糖酶,使发酵过程中海藻糖的累积下降。为了提高海藻糖的产量,去除海藻糖酶的活性是必要的。野生型菌株通过EMS的诱变作用,筛选出了1株不能同化海藻糖,但生长速率不变的突变株。该突变株与野生型菌株相比能够利用淀粉发酵累积更高含量的海藻糖,与野生型菌株相比, 突变株细胞的酸性海藻糖酶的活性低3倍,中性海藻糖酶的活性低37倍。这意着酸性和中性海藻糖酶活性的降低对该突变株的海藻糖产量的提高起关键作用。
在2008年王鹏，丁振教授[5]以海藻糖合酶产生菌株QD17为出发菌株,经过紫外诱变和化学诱变最终选育出一株高产海藻糖合酶突变株JL-2-24,其海藻糖生产能力由出发菌株的每g干菌体可转化麦芽糖生成海藻糖927.38mg增加到2458.5mg,提高了2倍。将紫外诱变、化学诱变与空白对照可以发现,亚硝基胍诱变的效果最好。诱变株JL-2-24生长良好,经10余代传代试验,传代稳定。
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