前体和诱导子对桑悬浮细胞中次生物积累的影响(4)
因本实验研究的桑树细胞为多细胞生物，多细胞的遗传操作又有一定的难度，所以一般先将植物组织进行诱导形成良好生长的愈伤组织，然后转移到悬浮培养体系中进行悬浮培养，上升到细胞层次水平，就可以利用相对比较完善的单细胞培养技术进行实验研究。植物细胞悬浮培养有3种培养方式，分批培养、半连续培养和连续培养，在我们的研究中采用分批培养的方式。
1。3。2 植物细胞悬浮培养的影响因素
悬浮细胞培养受到许多因素的影响，主要有细胞自身的特性和外部物理和化学因素，具体包括外植体、愈伤组织、培养基成分、培养条件。
1。3。2。1 外植体
外植体的生长时间和它现在的生理状态决定诱导胚性愈伤组织结果的好坏。选择合适的外植体是能否诱导并长期保持愈伤组织良好生长的关键因素之一[25]。不同的植物在对外植体选择上的要求也有较大的差异。一般草本植物都选取植物的嫩叶作为外植体，在我们实验中我们选取了新鲜的桑叶作为外植体。合适的外植体，保证了胚性愈伤组织的高再生率，胚性愈伤率较高的基础上也更容易建立起搞笑的植物细胞悬浮培养体系[22]。
1。3。2。2 愈伤组织
植物细胞悬浮培养的细胞多来源于愈伤组织，愈伤组织的生长状态的优劣决定着后期建立的悬浮细胞培养体系是否稳定。一个成功的悬浮细胞培养体系有几个必需条件：①分散性好的细胞②生长迅速的小细胞团③均一性良好的细胞。所以，在择好的愈伤组织时，最佳选择为颗粒小、疏松、湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织。这样的愈伤组织经过之后，再继代至稳定后代，最后进行悬浮培养。
1。3。2。3 培养基
①基本培养基：培养基是植物组织培养中最重要的基质，主要为植物细胞基本生长所需的无机盐、微量元素和碳源。作为悬浮培养中的一个环节，培养基的选择也十分重要。在进行植物细胞悬浮培养时，应注意根据不同的培养对象、阶段效果，选择正确的培养基。MS（1/2 MS培养基）和B5培养基是实验中常用的基本培养基。我们的实验中使用的培养基是MS培养基。
②激素：在培养基中加入适量的激素，可以使得细胞可以更好更快的生长和分裂。激素在培养体系中一般起到一种促进生长的作用，促进细胞分裂或者促进分化等。实验中常用的激素是是氯苯氧乙酸 （2,4-D）、萘乙酸 （NAA）和6-苄基嘌呤（6-BA）等 [17,20]。
③有机物：植物细胞悬浮培养中常添加一些有机物，如肌醇、氨基酸和蔗糖。蔗糖是培养体系中常用的碳源和能源物质，还可以维持细胞的渗透压。适合的蔗糖溶液可以促进细胞的生长，刺激次生物质的生物合成起，但当浓度过高时会抑制细胞的生长[26-30]。
1。3。2。4 培养条件
①接种量：细胞的密集程度对悬浮培养中细胞的生长影响较大。植物细胞培养要在一定的密度上细胞才会进行生长，而如果接种的细胞密度过高，会引起培养液粘度过大，使得细胞生长吸收氧气和营养物质受到阻碍，导致细胞生长受到抑制甚至出现死亡。所以在进行悬浮培养之前，要先根据实验的需求确定合适的接种量[22]。
②pH值：通常植物细胞生长最适pH 值为5。8-6。0[22]。pH会影响外植体对营养物质的吸收，会引起细胞质膜通透性的变化,会影响细胞的生长和次生物质的积累。所以合适的pH值也是关键的因素之一。
③其他：植物细胞悬浮培养还受温度、光照条件和摇床转速的影响，在此简要介绍。
温度主要考虑植物所处的生态环境条件，高温适合热带植物，低温适合低纬度或者高山植物。通常控制在20-28℃之间，最适合温度为23-27℃。
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