近年来，诸多研究表明，除了自养菌，硝化反应也可以由某些异养菌完成；反硝化作用在好氧条件下也能由某些细菌完成。随着异养硝化细菌及好氧反硝化细菌的发现[3]，打破了传统理论中关于硝化作用和反硝化作用的观点。越来越多的研究表明，异养硝化菌和好氧反硝化细菌具有能利用有机物、生长速度快、对环境适应能力强等优点[4]，可以有效提高脱氮效率。

本研究从杭州西溪国家湿地公园的土壤中分离筛选高效脱氮的好氧反硝化细菌，并进行菌种的鉴定，以期为生物脱氮的理论和应用提供参考。

2。材料与方法

2。1土壤样品

样品于2015年10月底采自杭州西溪国家湿地公园。采集0-10cm的表层土壤，4℃冰箱保存，用于富集分离。

2。2培养基论文网

好氧反硝化菌富集培养基：NaNO2 2。0 g、柠檬酸5。0 g、KNO3 0。5 g、K2HPO4 1。0 g、KH2PO4  1。0 g、MgSO4·7H2O 0。2 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2-7。6。

好氧反硝化菌分离培养基（BTB培养基）：KNO3 1。0 g、KH2PO4 1。0 g、FeCl2·6H2O 0。5 g、CaCl2·7H2O 0。2 g、MgSO4·7H2O 1。0 g、琥珀酸钠8。5 g，琼脂20。0 g，1。5% 溴百里酚蓝1。0ml/L，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2。

反硝化培养基：KNO3 3。0 g、柠檬酸钠5。0 g、K2HPO4 1。0 g、KH2PO4 1。0 g、MgSO4·7H2O 0。2 g，补充蒸馏水至1 L，pH 7。2-7。6。

丙二酸盐利用试验培养基：（NH4）2SO4 2。0 g，K2HPO4 0。6 g，KH2PO4 0。4 g，NaCl 2。0 g，丙二酸钠3。0 g，酵母膏1。0 g，溴百里酚蓝0。025 g，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。0-7。4。

西蒙氏柠檬酸盐利用试验培养基：Na3C6H5O7·2H2O 2。0 g，NaCl 5。0 g，MgSO4·7H2O 0。2 g，(NH4)H2PO4 1。0 g，K2HPO4·3H2O 1。0 g，溴百里酚蓝1%水溶液10 mL(其他成分溶解之后再加入)，Agar 15 g，调节pH 7。0加入指示剂。

糖、醇类发酵培养基：蛋白胨2。0 g，NaCl 5。0 g，K2HPO4 0。2 g，Agar 7。5 g，溴百里酚蓝1%水溶液3 mL，终浓度为1%糖、醇，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。0-7。2。本实验所用到的糖、醇包括葡萄糖，木糖，果糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，半乳糖和甘露醇。

七叶灵水解、硝酸盐还原、反硝化、淀粉水解试验试验培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别添加终浓度为0。1%的七叶灵和0。05%的柠檬酸铁、0。1%的KNO3、1%的KNO3及1%可溶性淀粉，调节pH 7。0-7。6。

吲哚试验培养基：将胰胨水溶液稀释至1%，调节pH 7。2-7。6。

苯丙氨酸脱氨酶试验培养基：Na2HPO4 1。0 g，酵母膏3。0 g，NaCl 5。0 g，Agar 15。0 g，DL-phenylalanine 2。0 g，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。0。

精氨酸双水解试验培养基：K2HPO4 0。3 g，蛋白胨1。0 g，NaCl 5。0 g，酚红0。01 g，L-arginine 10。0 g，Agar 7。5 g，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。0-7。2。

吐温水解试验培养基：蛋白胨10。0 g，NaCl 5。0 g，CaCl·7H2O 0。1 g，Agar 9。0 g，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。4。灭菌培养基温度降至40-50℃，加入已灭菌的Tween 80至终浓度为1%。

卵磷脂酶培养基：取冷却至50℃左右的50 mL灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，加入10 mL卵黄悬液，混匀后到平板，过夜即可使用。

产H2S试验培养基：NaCl 5。0 g，蛋白胨10。0 g，牛肉膏10。0 g，Cysteine 0。5 g，补充蒸馏水至1 L，调节pH 7。0-7。4。

生长温度和耐热培养基：LB液体培养基。文献综述

耐盐培养基：LB液体培养基+终浓度6。5% NaCl。

2。3分离筛选

2。3。1富集与分离

取10g土壤样品加入100ml富集培养基中，30℃、160r/min摇床上振荡培养，每隔24h向培养液中加入5% KNO3和5%NaNO2溶液1ml，重复上述操作培养3d。用无菌水将上述的富集培养液进行适当稀释后，吸取0。2mL涂布于BTB培养基平板上，30℃恒温培养2-3d。由于反硝化反应是产碱过程，当有反硝化反应发生，会使BTB培养基的指示剂溴百里酚蓝呈现蓝色，即菌落会呈现蓝色或蓝色晕圈。从BTB培养基平板中挑选出蓝色晕圈的单菌落，平板上连续划线分离，直至获得纯培养物，4℃斜面保存。