水稻早期花药发育相关RING类E3连接酶的筛选(3)
在 msp1 突变体中，花药壁细胞发育紊乱，绒毡层完全消失，而原本位于绒毡层的细胞
被过量的小孢子母细胞所代替。尽管小孢子母细胞在数量上增多了，但这些细胞并不能
顺利通过第一次减数分裂初期，因此造成了雄性不育的表型[3]
。 OsTDL1A/MIL2 是拟南芥中 TPD1 的同源蛋白。研究表明拟南芥中该蛋白可能是
EXS/EMS1 的配体，而后者正是 MSP1 的同源蛋白[4]
。酵母实验证实OsTDL1A/MIL2 确
实会与MSP1 在体外有相互作用。该基因突变的植株 mil2 产生了与msp1极其相似的雄配子不育的表型[5]
。此后研究表明OsTDL1A-MSP1 复合体影响了转录因子 OsTGA10和
谷氧还蛋白OsGrx_11 的表达，证明 OsTDL1A-MSP1 复合体可能通过改变细胞氧化还原
状态来决定其命运[6]。
本课题组以前的工作发现了一个同样是花药发育早期出现问题的水稻突变体
mpl1-1。与msp1 不同的是 mpl1-1原本位于小孢子母细胞位置的细胞被一些形似营养细
胞的薄壁细胞所代替。相应的，MPL 编码一个C 端带有 EAR基序的具有转录抑制活性
的蛋白。其具体调控机制还不清楚。拟南芥中控制叶片发育的含有 EAR基序的蛋白 TIE1
被证实是一个转录抑制因子[7]
，在体内被 RING 类 E3 连接酶泛素化降解[8]
，暗示 MPL
可能有相似的调控机制。本论文拟通过多种方法寻找调控 MPL 的可能的 RING 类 E3
酶泛连接酶。
1．2 RING 类 E3泛素连接酶
泛素化途径是在真核生物中广泛存在且最为重要的蛋白修饰途径，E3 泛素连接酶
是泛素化系统的非常重要的决定降解特异性的酶。E3 泛素连接酶将泛素转移至特定底
物以引起底物泛素化修饰后调控蛋白的功能或降解[9]
1．2．1 作用机理
RING 锌指基序在 1991 年被首先提出[10]
。其基本结构可以写成以下氨基酸序列：
Cys-X2-Cys-X(9-39)-Cys-X(1-3)-His-X(2-3)-Cys-X2-Cys-X(4-48)-Cys-X2-Cys （这里 X代表任意氨
基酸残基）[11]
，这是一个锌指结构，与其他锌指结构不同的是，RING 结构域不结合核通过解析c-Cbl-UbcH7复合体的结构Zheng等发现RING结构域中形成锌指结构的
部分与连接着第一和第二协调位点的中心螺旋共同在结构域中形成了一个较浅的裂缝
以结合 E2。目前人们普遍推测 RING 型 E3 连接酶催化了泛素由 E2 结合酶直接向底物的转移[12]
1．2．2 转录调控因子调节与自动反馈循环
作为生物蛋白水平调控的重要一环，E3 连接酶与很多转录调控因子有相互作用。
通过泛素化后降解转录调控因子，机体可快速关闭或激活某些重要基因的表达以起到调控作用。有趣的是，部分 E3 连接酶正是它们所调控的转录因子的下游基因，这样的调
控模式形成了一个自动反馈循环。在这个循环中，E3 连接酶与转录调控因子分别在蛋
白水平和转录水平调控对方，以达到某种平衡。这种平衡可被某种信号打破以达到快速
响应的作用，信号消失后，平衡又会被自动重新建立以文持机体的稳定状态。
其中最典型的就是 p53-MDM2 调控通路。p53 是第一个被发现的抑癌基因[13]，p53
蛋白在生理应激反应中被激活，导致细胞 G1停滞或细胞凋亡。MDM2则是以 p53为底物的 E3 连接酶[14]
, Mdm2 的转录由 DNA 损伤后的 p53 蛋白诱导，然后 MDM2 蛋白与
p53 结合阻断其作为肿瘤抑制因子的活性并促进其降解。因此，这两种蛋白质形成了自
我调节反馈循环，其中 p53 正调节 MDM2 水平，MDM2 负调节 p53 水平和活性。紫外
线（UV）照射后，MDM2 信使 RNA 和蛋白质水平立即以不依赖于 p53 调节的方式下