已有研究发现在自然状态下，发现通过人为下调参与调节植物细胞周期的内源RBR 基因后，粉虱传双生病毒仍然可以侵染成熟的寄主植株。这一结果表明，双生病毒通过调节与现有发现不同的未知因子，完成了从分裂停滞期到分裂期的细胞周期转变(10)。这需要我们进行进一步的深入研究。

Rep蛋白基因结构与其功能密切相关，例如在ACMV的序列中，存在一个能够与已知的视网膜母细胞瘤蛋白植物同源的细胞周期蛋白FRBR相互作用的功能区域（RXL），是一个病毒参与调控细胞周期的一个蛋白组件。野生型Rep如果在RXL这个功能区域上产生变异，会导致ACMV在裂殖酵母体内的复制不能进行。这表明ACMV的Rep蛋白可以通过RXL结构与一个或多个酵母蛋白相互作用。在自然侵染中RXL结构域对于ACMV在烟草上的病毒侵染至关重要，在ACMV的侵染性克隆中对于这一结构的变异使得病毒侵染后产生的症状减轻。

针对病毒复制机理的研究，本实验室构建了研究双生病毒 Rep 复制蛋白与植物内源相关因子互作的实验体系，包括：含双生病毒复制起始位点以及报告基因的转基因烟草pOri2，搭载相关植物内源基因的 PVX 基因沉默载体，以及通过农杆菌介导的双生病毒元件的表达载体。通过这一实验体系可以有效地研究双生病毒元件与植物内源基因的互作。

对于ACMV中的Rep蛋白的基因序列里发生单核苷酸的突变后，该突变位点对病毒复制的影响程度可以利用这一研究平台来研究，从而可以研究病毒复制与病毒分子结构的互作调控的机制。我们计划利用Overlapping PCR技术人为构建Rep蛋白的点突变体，然后通过农杆菌接种转基因烟草pOri2来验证其复制功能是否发生变化，从而把突变的结构与蛋白的功能相联系，希望获得有意义的基因结构序列与作用域。

本研究对病毒蛋白与寄主之间以及病毒蛋白与介体之间的互作，可以鉴定与Rep有关系的寄主因子，了解Rep蛋白如何与寄主蛋白相互作用的，这一研究将对我们了解植物病毒的核酸复制、基因表达调控、致病机制及与植物的互作因子认识与鉴定具有重要意义。

第一章 ACMV 复制蛋白基因定点突变体的构建

引言文献综述

针对病毒复制机理的研究，本实验室构建了研究双生病毒 Rep 复制蛋白与植物内源相关因子互作的实验体系pORI2系统，这一有特色的实验体系可以有效地研究双生病毒元件与植物内源基因的互作。

氨基酸定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。而采用重叠引物PCR介导的定点突变实验是一种快速有效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。

对于ACMV中的Rep蛋白的基因序列里发生单核苷酸的突变后，该突变位点对病毒复制的影响程度可以利用pORI2系统平台来研究，从而可以研究病毒复制与病毒分子结构的互作调控的机制。我们计划利用Overlapping PCR技术人为构建Rep蛋白的点突变体，然后通过农杆菌接种转基因烟草pOri2来验证其复制功能是否发生变化，从而把突变的结构与蛋白的功能相联系，希望获得有意义的基因结构序列与作用域。

图1 pOri2转基因本氏烟双生病毒复制研究系统示意图