无机盐液体培养液:NaCl 1。00g,K2HPO4  1。50g,KH2PO4  0。50g,NH4NO3 1。00g,MgSO4·7H2O 0。20g,去离子水1000mL。

无机盐固体培养基:无机盐液体培养液,琼脂 1。5%~2%。

2。3  研究方法

2。3。1  金橙II降解酶基因的克隆论文网

通过查阅文献比对分析,将疑似的ORF用PCR 扩增并克隆到pMD-18T载体上,转化到大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)中,进一步验证其金橙II降解活性。

菌株总DNA的制备:

采取高盐法提取菌体总DNA:接种菌株至100mL的LB液体培养基中,30℃振荡培养。12000g离心1min收集菌体,加等体积的TE(pH8。0)洗涤并重悬菌体于10mL TE中,加溶菌酶至100μg/mL,37℃水浴至体系澄清。加终浓度2%SDS,加蛋白酶K至100μg/mL,37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡15秒。等体积酚:氯仿:异戊醇反复抽提,12000 r/min离心10min,至无白色界面。转移收集上清,加0。6倍体积异丙醇沉淀,毛细管捞出絮状沉淀,70%乙醇洗涤沉淀,乙醇挥发后溶于200μL TE(pH8。0)中,保存备用。

疑似基因的PCR扩增:

引物设计:

以已知报道的基因mheI来设计引物,并在引物上分别加入了NdeI和XhoI限制性酶切位点以方便克隆和表达载体的构建。

P2682-azo705F:GGAATTCCATATGAGCAAAGTATTGGTTCT

P2682-azo705R:CCGCTCGAGGGCAGCAACCACCTGAGAC

PCR反应体系(50μL):10×PCR buffer(含Mg2+)5μL,dNTP 4μL,引物各1μL,模板DNA 1 μL,Taq酶(5U/μL)1 μL,重蒸水38μL。

反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1。5min,30个循环,72℃保持10min。

2。3。2  PCR产物TA克隆验证

将PCR产物与T载体16℃过夜酶连。

酶连体系(10μL):重蒸水3。5μL,PCR产物4μL,pMD18-T载体1μL,T4连接酶0。5μL,T4连接酶10×Buffer 1μL。

E。coil DH5α菌株感受态细胞制备与转化

从-70℃冰箱中取出用甘油保存的菌株E。coil DH5α于固体LB平板上,37℃过夜培养。待长出菌落后,用接菌环挑取单菌落于100mL液体LB三角瓶中,37℃于摇床上200r/min振荡培养至OD600为0。5左右。4℃条件下,6000r/min,离心5min以获得菌体。用10mL TSB重悬菌体,并于冰上放置10min,分装后于-70℃保存。

取酶连产物10μL,5*KCM溶液10μL,无菌水30μL置于放在冰水浴中的1。5mL离心管中。从-70℃冰箱中取出感受态E。coil DH5α立即融化,取50μL加入上述1。5mL离心管中轻轻吹吸混匀。放置冰水浴中20min后,在室温下再放置10min。加入500μL液体LB,置于摇床上,37℃条件下150r/min振荡培养50min复苏。然后在6000r/min离心2min浓缩菌体涂布氨苄平板筛选。

阳性转化子筛选文献综述

质粒DNA的小量提取:将筛选到阳性转化子扩大培养后,取1。5mL菌液,12000r/min 离心1min,用TE重悬洗涤离心1~2次。取菌沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。加200μL新配制的溶液II,室温下放置3~5min。加150μL用冰预冷的溶液III,冰上放置5min。12000r/min离心5min,将上清转移至另一离心管中,加2倍体积的冰无水乙醇,颠倒混合,于室温下放置5~6min使质粒沉淀。12000r/min离心5min,弃去上清液,将离心管倒置于吸水纸上,待所有液体流出后,用1mL 70%乙醇洗涤2次并风干沉淀。待离心管中质粒变透明后,用40μL TER溶解质粒,-4℃待用。

酶切鉴定:取重蒸水5μL,上述提取质粒DNA 3μL,10×H Buffer 1μL,XhoI酶0。5μL,NdeI酶0。5μL,置于37℃培养3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析提取的质粒DNA是否含目的基因。

上一篇:高产棉花新品系HB-14的光合性能及农艺性状调查研究
下一篇:UV-C复合1-MCP处理对西葫芦采后抗氧化衰老的抑制效应

偶氮染料金橙II降解菌株...

偶氮染料金橙II降解菌株...

固定化酵母全细胞催化羰基还原反应的研究

偶氮还原酶基因azo606的克...

羰基还原酶产生菌的筛选与分离

羰基还原酶产生菌的筛选与鉴定

硝酸还原酶及一氧化氮信...

聚乙二醇溶液浸种对栝楼...

大数据时代背景下的企业...

家庭教养方式对小学生学习行为的影响

MJT道德判断两难故事测验问卷

冷链物流企业绩效国内外研究现状

论《青春之歌》林道静成长过程中的爱情因素

国内外列车空调控制的研究现状

地方农业院校内涵式发展问题研究【3411字】

射手座男和什么星座最适...

快速康复护理干预茬胃癌...