土壤pH对活血丹生长及其药材品质的影响(3)
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验所用活血丹材料采自江苏省南京市紫金山附近，经郭巧生教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹G. longituba。2016年7月定植于南京农业大学中药材研究所实验大棚，自然越冬，2017年3月植株恢复生长后，选取健壮、长势相近植株进行处理。
本实验共设置pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5五个处理，每个处理设置5盆重复，每盆5株活血丹。处理前分别调整土壤pH值到相应值，试验中通过浇撒相应pH值的硫酸-氢氧化钠缓冲液进行调试，每3天进行一次。
1．2 仪器与试剂
仪器：分光光度计（AlpHa-1506，上海市谱元仪器有限公司）、烘箱（DHa-3140N，上海精宏实验设备有限公司 大仓精宏仪器有限公司）、台式高速冷冻离心机（5811XL441125，德国Eppendorf -AG）、超声波清洗机（PS-60A）、电子天平（BSM220.4，上海卓精电子科技有限公司）、美国Waters 2695/2996型液相色谱仪（美国Waters公司）。
试剂：蒽酮，乙醇，磺胺，萘基乙烯胺，石英砂，碳酸钙，浓硫酸，亚硝酸钠，甲硫氨酸，NBT，EDTA-Na2，核黄素，NaH2PO4•2H2O，KNO3，Na2HPO4，无水乙醇，TCA，牛血清蛋白，高锰酸钾，过氧化氢，硫代巴比妥酸（TBA），甲醇，醋酸钠，醋酸，三氯化铝，氢氧化钠，乙腈（除乙腈、甲醇为色谱纯外，其余均为分析纯）。
1．3 方法
1．3．1活血丹生长指标测定
采收前，每盆随机选取3株进行测定，叶片长度与宽度、叶柄长度均选取自植株基部往上数第3节处叶片，采用直尺测量；株高是植株基部到最高部位的距离，采用直尺测量；茎节间距离选取植株基部往上第3~4节间，用直尺测量；茎粗选取植株基部往上第3节基部，用游标卡尺测量。
1．3．2 活血丹生理指标测定[19]
（1）叶绿素含量测定 浸提法。取活血丹叶片0.2g，剪碎，放于25mL试管中，每管加入20mL 95%乙醇，振荡，保证叶片被液体完全浸泡后，放置24h，至绿色消失。取上清液，以95%乙醇为空白，在波长665 nm、649 nm和470 nm处侧吸光值。
（2）可溶性糖含量测定 蒽酮比色法。取叶片0.3g于刻度试管中，加入5-10 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次），提取液过滤入25 mL 容量瓶中，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至刻度。吸取样品提取液0.5 mL 于20 mL 刻度试管中，加蒸馏水1.5 mL，按标准曲线制作测定吸光度，计算可溶性糖的含量。
标准曲线的制备 取6支20 mL刻度试管（编号为1、2、3、4、5、6），依次加入100 ug∙L-1蔗糖液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，然后按顺序向试管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL 浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1 min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630 nm 波长下测其吸光度，以糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，求得标准曲线为Y=0.0053x-0.0058，R2=0.9978（n=3）。
（3）游离氨基酸总量测定 茚三酮显色法。取活血丹叶片0.5 g，剪碎后于研钵中加入 5 mL 10%乙酸，研磨后用蒸馏水稀释至100 mL，过滤。取滤液1.0 mL于20 mL干燥试管中，再加入无氨蒸馏水1.0 mL，接着加入0.5 mL 乙酸–氰酸盐缓冲液和3.0 mL水合茚三酮，然后按标准曲线制作步骤显色、比色。
标准曲线的制备 取6支20mL刻度试管（编号为1、2、3、4、5、6），依次加入氨基酸标准溶0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，无氨蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL，再加入水和茚三酮3 mL、乙酸-氰酸盐缓冲液0.5 mL，混匀，加塞子后沸水浴中加热15 min，取出后冷却并摇动，待其呈现蓝紫色时用60%乙醇定容至20 mL，在波长570 nm下测定吸光度（以1号空白管为参比），以氨基酸微克数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程Y=0.2239x+0.0194，R2=0.9990（n=3）。