基于SSR的不同群体鳜遗传多样性初步研究(2)
微卫星DNA又叫简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSRs），在真核生物的基因组中普遍分布，常表现出高 度的长 度多 态性[6-9]。因其操 作简单、多 态性高、重 复性好和共 显 性遗传等特点，而广泛应用于动、植物的遗 传图谱构 建、群 体遗 传多 样性分析、亲 缘关系分析和种 质资 源鉴定等方面[10]。彭敏燕[11]对采自赤壁、常德和怀化的3个不同野生翘嘴鳜群体进行SSR研究，得到的平 均基 因分 化指数（Fst）为0.0383，可见，3个群体间的遗 传分 化水 平较低。杨凯等[12]对湖北、广东的2个养殖翘嘴鳜群体以及采自长江的1个野生翘嘴鳜群体进行SSR研究分析比较，得到的平均期望杂合度（He）值分别为0.5472、0.4634和0.4811，可以看到，遗传多样性最高的为湖北养殖群体。但有关长江中下游水域的野生鳜群体和养殖群体的遗传多样性研究报道尚未见到。本课题对6个不同群体鳜的遗传多样性及群体间的遗传分化进行SSR分析，以期更好地保 护和恢 复鳜种 质资源。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验分析的鳜来自6个群体，分别采自长江铜陵江段（TL）、长江当涂江段（DT）、长江安庆江段（AQ）、太湖（TH）、高邮董氏养殖场（GY）、靖江滨江水产养殖场（JJ），每个群体的个体数依次为7尾、8尾、8尾、9尾、30尾、34尾，样品用无 水酒 精保存，并带回实验室备用。
1．2 方法
1．2．1 微卫星引物合成
微卫星引物序列参照匡刚桥[13]的研究，引物由上海生物工 程技 术服 务有限公司合成，从合成的41对引物中筛选出10对，引物信息见表1。
表1 经筛选的10对鳜鱼微卫星引物
Table 1 10 SSR primers available to PCR amplification in Siniperca chuatsi
位点
Locus 引物序列（5′-3′）
primer sequences(5′-3′) 退火温度（℃）Annealing temperature 产物长度（bp）
product size AGCCATCACCATCTGCCTA
TGTGCGGTGTCTGTATTCG
AGGTGGGAAACGATAGAGG
AGTGTTTATGCCCTCTGTCA
GCCATCTATCATCAACAAAATC
TCCCAGTTATTCACTCCCAT
TTCCCATGCAGCAAAGGT
TAGGGGGGCTGAGAGCATAA
AGCCATCACCATCTGCCTAC
CACTAAAACCCTGCCTCCC
TGGGTTACAGAGCAGGAGGT
TCTGATCACAGGTCTGTAGGCT
GAACGAGTATCGCATTAGCC
GAAAGTTGTGCAATGCGC
TGGTCTGGTCCTGTTTGTGTC
GGCATGTAGCATGACATGCA
GCAGTTTCCTGGTTACTCCTC
GCTTTGCTGAGTGGTTAGAGT
AGGAAGGATTTAGTCAAGGTG
ACAAGCTCCCAGCCTGAT 56
1．2．2 基因组DNA提取
使用上海生物工程技术服务有限公司生产的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，从鳜鱼的肌肉组织中提取基因组DNA，再用1%琼 脂糖凝 胶电 泳检测提取效果，-20℃下保存备用。过程如下：
（1）取离心管，并进行编号。剪取鳜鱼肌肉组织少于100 mg，放入离心管中，用移液枪加入200μL GA缓冲液，振荡混匀约15 s。再加入20μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，振荡混匀约15 s，之后进行简短离心，去除管壁内侧的水珠。放入56℃的烘箱进行消化。
（2）在烘箱内消化约4 h，鳜鱼肌肉组织基本完全溶解，将离心管从烘箱取出后简短离心，去除管壁内侧的水珠。
注意：在肌肉组织进行消化的过程中，最好每小时将样品取出并充分摇晃2-3次，以保证肌肉组织的充分消化。
（3）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，放入70℃烘箱10min，溶液变得清亮，将离心管取出后简短离心，去除管壁内侧的水珠。
注意：在加入缓冲液GB时，有可能会产生白色沉淀，一般情况下放入70℃烘箱后会消失。若放入烘箱后溶液没有变清亮，则说明裂解得不彻底，可能会导致提取的DNA不纯，并且DNA的提取量也会变少。