手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性(3)
色谱纯乙腈；色谱纯甲醇（TEDIA， Fairfield, USA).；超纯水；胎牛血清（优级纯，四季青，中国)；DMEM（Gibico, 澳洲）；磷酸缓冲液（Sigma，美国）；BCA蛋白分析试剂盒（赛默飞世尔，美国）；CCK-8试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（南京建成生物工程研究所，中国）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）；过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）。
2实验方法
2.1甲基异柳磷手性拆分仪器条件的确定
2.1.1仪器和色谱条件
使用Aglient1200高效液相色谱仪和手性Lux Cellulose-3（250mm×4.6mm i.d.，5μm）进行甲基异柳磷对映异构体样品的色谱分离和分析。使用乙腈:水:甲醇（31:57:12，v/v/v）溶液作为流动相，进样体积为20μL，流速为0.8mL/min，柱温25℃，紫外检测器的检测波长为228nm。
通过采用保留因子(k)、分离因子(α)和分离度(Rs)这三个色谱参数评价甲基异柳磷旋光异构体的分离效果。计算方程如下：
k=(tR-t0) / t0
α=k2 / k1
Rs=2(t2-t1) / (W1+W2)
式中，tR表示溶质的保留时间，t0表示死时间；k1、k2分别表示第一个洗脱峰和第二个洗脱峰的保留因子；t1、t2分别表示第一个洗脱峰和第二个洗脱峰的保留时间；W1、W2表示第一个洗脱峰和第二个洗脱峰的基线宽度。一般认为，分离度Rs≥1.5时，两峰达到基线分离[14]。
甲基异柳磷两对映体实现基线拆分的典型色谱图如下分离色谱图：
图2 甲基异柳磷在 Lux cellulose-3分离色谱图
2.1.2绝对构型
配制100mg/L的甲基异硫磷异构体乙腈溶液，采用Jasco J815圆二色谱仪在室温下测定190-400纳米波长的吸光值，扫描速度50纳米/分钟，比色皿厚度0.1 cm，取三次扫描的平均值，绘制吸收曲线。
手性化合物对映异构体的描述通常借助绝对构型或旋光性来实现，本实验利用试验测定的圆二色谱和利用TDDFT方法计算的ECD谱图比对确定了两映体的绝对构型，通过分析实验测定和理论计算的电子圆二色性光谱发现，第一个峰为S-(+)-甲基异柳磷，第二个峰为R-(-)-甲基异柳磷。利用旋光仪测定了两对映体的旋光度。两个对映体的绝对构型、比旋光度分别为：Peak 1：S-(+)-甲基异柳磷，比旋光度为 = +19.925 (CH3CN)；Peak 2：R-(-)-甲基异柳磷，比旋光度 = -19.326 (CH3CN)。
图3 甲基异柳磷对映体预测的ECD光谱和实验测量的ECD光谱
2.2相关实验用液的配制
Hep G2完培配制：DMEM+10%胎牛血清+30滴NaHCO3；
步骤：DMEM(25mL×9)+胎牛血清（25mL×1）+30滴NaHCO3
2.3细胞的培养及处理
2.3.1细胞冻存
细胞冻存时，取对数生长期的细胞，1000转/min，沉淀5min，弃去上清液，以预先配制的冻存培养液（10%二甲基亚砜 （DMSO））+90%胎牛血清）重悬，调整冻存液中的细胞密度至1×107-5×107个/mL，按每管1mL转到冻存管中，标记细胞名称与冻存日期。先放入4℃冰箱中10-20min，其次放入-20℃冰箱中1-2小时，再转移到-80℃冰箱过夜，最后转入液氮罐中长期保存。
2.3.2细胞复苏
复苏细胞的过程要求尽量快，将冻存的细胞从液氮罐子取出，迅速放入预热的37℃水浴中，将细胞面浸入水面以下，并不断摇晃使其尽快融化（1min左右），在超净工作台内尽快用培养液稀释至原来的10倍以上，1000转/min离心5min，弃去上清液，加入新鲜培养液吹打均匀后置于培养箱内培养，次日更换一次培养液，继续培养。