利用C堡为受体的穞稻染色体片段置换系（CSSL）定位水稻落粒性QTL
毕业论文关键词：水稻；落粒性；QTL；QTL
定位水稻作为人类重要的粮食作物之一，养活了近一半的世界人口。在中国，也有将近60%的人口将水稻作为主食，因此追溯栽培稻的起源和进化过程具有很大的意义。研究水稻的起源和驯化过程发现：在生理特征方面，野生稻种子成熟后大多容易落粒，而栽培稻种子成熟后几乎不落粒，使得人们更容易收割。易落粒品种通常表现田间易落粒，收割过程造成大量浪费，收获产量低；难落粒品种通常表现落粒困难，同样对收获有不利影响。因此，适宜的落粒性是保证水稻收获量的重要条件。水稻的落粒性是研究水稻驯化的重要生理性状之一。 随着分子生物学技术的发展，克隆驯化相关基因并了解其作用机理，将有助于人们从分子角度了解水稻驯化的过程。通过对栽培稻和野生稻以及栽培稻之间后代的遗传研究，迄今已定位了 5个落粒性基因。即 sh-1、sh-2、sh-3、sh-4 和 sh-h。分别定位在水稻的第 11、1、4、3、7 染色体上。迄今，国内外研究者共克隆了 5 个控制水稻落粒性的基因。Qsh1：位于1 号染色体上。亲本为易落粒籼稻品种 Kasalath 和不易落粒粳稻品种日本晴。 qsh1 起始密码子上游 12kb 处 1 个 SNP(G-T)阻止了形成离层区细胞的表达，使得谷粒难以从植株上脱落。SH1：位于3 号染色体上。亲本为易落粒籼稻品种南京 11的突变体 SR-516。突变体 osSH1 中的第三个内含子中有超过 4kb 的插入，导致 osSH1 转录水平降低形成不落粒表型。SHA1：位于 4号染色体上。亲本为广陆矮四号和野生稻 w1943。SHA1 与 SH4 有 98%的氨基酸序列一致，但是不影响离层区的形成。SH4：位于 4 号染色体上。亲本为籼稻品种CL16、Teqing 和野生稻。该基因编码一个功能未知的转录因子，控制水稻的离区发育。 Sh-h： 位于 7 号染色体上。 亲本为韩国粳稻品种 Hwacheong 中的突变体。该基因可以在穗子发育中控制离层细胞的分化。在 QTL 方面, Fukuta 等(1996)利用籼粳交后代 F2 分离群体, 对落粒性进行了 QTL 分析, 在第1、2、5、11 和12 染色体上检测到5 个QTL,其中第1染色体上的QTL为主效基因, 推测它可能位于 sh-2 附近。Xiong 等(1999)利用 Aijiaonante/P16 的 F2 分离群体, 共检测出 5 个落粒性 QTL, 分别位于水稻第 1、3、4、6 和 8 染色体上。Cai 和Morishima(2000)利用重组自交系群体在水稻第 1、4、8 和 11 染色体上检测到4 个落粒性 QTL。沈圣泉等(2004)利用珍汕 97B/密阳 46 所构建的 RIL 群体, 分别在第1、2、3、6、7 和 11 染色体上检测到 7 个落粒性 QTL, 并分析了每个QTL的效应大小。 许旭明等(2005)利用重组自交系群体, 检测到与籼稻落粒性相关的7 个 QTL, 分别位于第 1 、2 、4 、6 和 7 染色体上。更好地了解水稻驯化的分子基础对于现代育种具有积极意义。 水稻落粒性基因的定位和克隆研究为了解水稻人工驯化积累了新素材， 也为育种应用提供了基因资源。同时，我们研究水稻落粒性，寻找出落粒性基因以及研究它的功能和表达将有助于全面了解水稻落粒进程，并以此为模板，去研究更多近缘物种的起源和进化。1 材料与方法1.1 试验材料、设备和试剂1.1.1 供试材料供试材料 1. 粳稻恢复系C 堡。由安徽省农业科学院选育，本研究室保存繁殖。C 堡植株谷粒灌浆后稻穗呈“鸡爪型” （图 3-1a） 。2. 穞稻。由江苏省农业科学院粮食作物研究所品种资源室 2005 年提供，本研究室保存繁殖。穞稻植株高秆，谷粒上有长芒（图3-1b） 。另外，还有 2015 年的 124 个家系和 2016 年的164 个家系。1.1.2 实验设备1）BS 423S 电子天平，2）SK-1 型快速混匀器，3）PCR 仪，4）移液枪 5）纯水处理系统，6）Centrifuge 5804R 型离心机，7）-20℃低温冰箱，8）电泳仪，9）电热恒温水浴锅，10）微波炉，11）通风厨，12）推拉力计1.1.3 主要实验药品和试剂1）SDS ，2）EDTANa，3）硼酸，4）氯化钠，5）盐酸，6）无水乙醇，7）三氯甲烷，8）异戊醇，9）琼脂糖，10）丙烯酰胺，11）硝酸银，12）氢氧化钠1.2 田间设计与性状调查2015 年正季将试验材料 C 堡、穞稻和 124 份近等基因系材料种植于南京农业大学江浦试验站，5 月 19 日干谷播种，6 月 18 日移栽于大田。每行 8 株，株行距均为 17cm×20cm。单本种植，常规栽培管理。在水稻分蘖期剪取两亲本和近等基因系共 126 份叶片，带回实验室放入-20℃冰箱冷藏，留待提取DNA。稻穗成熟时取每个小区的稻穗进行落粒性测量。2016 年正季将试验材料 C 堡、穞稻和 164 份近等基因系材料种植于南京农业大学江浦试验站，5 月 11日干谷播种，6 月 12 日移栽于大田。每行 8 株，株行距均为 17×20cm。单本种植，常规栽培管理。稻穗成熟时取每个小区的稻穗进行落粒性测量。1.3 实验方法1.3.1 试验材料 DNA的制备将取回的样品叶片剪碎放到 1.5ml 离心管中， 并放入小钢球， 利用球磨仪 （南京农业大学国家重点实验室平台提供）将叶片打成粉末状。将小钢珠移出，加入600μL 的 SDS 提取缓冲液，摇均匀；放到 65℃的水浴锅中水浴 30min；加入100μLKAc，冰浴 30min；加入 400μL 氯仿异戊醇混合液（V:V=24:1） ，摇床上充分摇匀(120rpm,30min)；室温下 12000r/min 离心 3min 左右，取上清液至新的灭菌离心管中；向上清液中再加入 400μL氯仿异戊醇混合液（V:V=24:1） ，将其置于摇床上充分摇匀；室温下 12000r/min 离心 3min左右，取上清液至新的灭菌离心管中；加入-20℃的无水乙醇 700μL，轻轻摇匀；置于-20℃冰箱自由沉降 30min以上，室温下 12000r/min 离心6min,倒掉上清液，用等体积的400μL 左右 70%乙醇洗涤沉淀，弃 70%乙醇，将 DNA 沉淀风干，加入 200μL0.1×TE 溶液溶解，配成 DNA母液，将抽提的DNA 母液放置于-20℃冰箱中贮存备用。1.3.2 PCR扩增PCR扩增采用10μL反应混合物： 20ngμL-1模版DNA工作液1μL， 25mmol•L-1MgCl20.6μL，2pmol•μL-1引物 0.7μL，dNTP0.2μL，10×SSR 缓冲液 1μL 和5U•μL-1TaqDNA 聚合酶 0.1μL，双蒸水 6.4μL。反应在 PTC-100 Peltiter ThermalCycler(MJ Research Inc.，USA)上进行。PCR 反应程序：95℃预变性 5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35 个循环；最后 72℃延伸 7min。