水稻响应赤霉素的小RNA鉴定与分析(2)
3讨论 16
3.1基于 small RNA-seq挖掘响应赤霉素的关键 miRNA16
3.2利用降解组测序技术验证预测结果17
3.3基于验证结果预测生物学功能及互作网络构建17
致谢18
参考文献18
水稻响应赤霉素的小RNA鉴定与分析
小分子RNA（small RNA, sRNA）是指一类约由19-24个核苷酸组成的非编码RNA，自1993年问世以来已经被多次证实为重要的生物调节因子[1]，根据其形成机制、结合效应蛋白和生物学功能的差异被分为microRNA（miRNA）、small interfering RNA（siRNA）和piwi-associated RNA（piRNA）三种[2]，其中piRNA仅在人体和动物中出现，miRNA和siRNA对植物的生长发育影响较大。MiRNA是一类长约20-24个核苷酸，具有调控功能的内源性非编码RNA，据估计高等真核生物中30 %的基因受到 miRNA 调控[11]，一般地，植物的miRNA通过与靶基因mRNA进行碱基互补配对切割靶位点，从而实现调控靶基因表达的功能。目前主要通过small RNA-seq来研究小分子RNA，采用最多的是Illumina公司的Solexa高通量测序技术，包括了HiSeqTM 2000和Genome Analyzer II x (GA II x)等平台，这些测序平台可一次性获得数百万条small RNA序列，快速全面地鉴定某组织在特定状态下的所有small RNA，为small RNA功能研究提供高效服务。
赤霉素(gibberellins, GAs)是植物体内重要的植物激素，主要通过促进细胞分裂来促使植物生长发育及其不同生长时期的转化，在调控种子休眠到发芽、从幼苗到成年植株以及营养生长到生殖生长的转化等生长发育阶段发挥着显著作用。赤霉素的信号通路主要由赤霉素、赤霉素受体、DELLA蛋白和介导DELLA蛋白降解的调控因子等组成，DELLA蛋白是一类在赤霉素信号转导中起显著阻遏作用的物质。在水稻中已经发现SLR1(SLENDER RICE1) 蛋白——一种DELLA蛋白，能够显著抑制赤霉素信号通路中下游的基因表达，其中就包括了GAMYB，该基因编码促进赤霉素应答基因的转录因子。目前有研究表明，参与赤霉素信号调控的miRNA包括了miR156、miR159、miR319、miR396等。Yu 等[3]研究发现许多DELLA蛋白能够直接结合miR156的靶标——SPL蛋白的转录因子，并且抑制其活性；他通过实验证明了在长日照条件下，由GAs介导的DELLA蛋白降解使得SPL介导激活了miR172和成花基因的表达，从而促进了开花，由此表明了miR156通过调控SPL蛋白活性参与GAs介导的成花发育过程。而miR159广泛参与到调控植物的叶片、花器官建成以及种子成熟等多个过程，研究发现这主要是因为miR159能够直接清除编码GAs合成和转导过程中特有的转录调控因子——GAMYB相关蛋白（MYB33，MYB65，MYB101）[4]。这些参与调控赤霉素信号通路的miRNA还存在一个共同点——同时受到其他激素的调控作用，实际上小RNA参与植物激素的调控网络十分复杂，更进一步的研究有待开展。
虽然对于水稻生长发育相关miRNA的研究工作已经开展了许多，但是针对赤霉素的还相对较少。截止到目前miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)有水稻713条miRNA成熟序列以及592条前体序列被收录[15]，而研究的热点多围绕在osa-miR156、osa-miR160和osa-miR397等与水稻多个生长发育过程有显著联系的miRNA，其他miRNA方面的研究有待完善。因此本研究以赤霉素为切入点，对水稻响应赤霉素的small RNA进行鉴定与分析，为阐明small RNA对赤霉素信号通路的调节机制打下研究基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试材料
水稻品种“ZH11”，由南京农业大学种业科学系实验室提供。
1．1．2 主要试剂
1) TRIzol、RNase ddHzO、DEPC原液