连云港盐田嗜盐古菌多样性研究(2)
1.2.6 PCR产物定量及均一化——荧光定量法 4
1.2.7 454高通量测序 4
2实验结果 5
2.1卤水样品总基因组DNA电泳分析 5
2.2 16S RRNA基因序列PCR扩增产物分析 5
2.3 454测序序列数据 6
2.4 嗜盐古菌的丰度情况 6
2.5嗜盐古菌的多样性分析 7
2.6嗜盐古菌组成多样性分析 8
2.6.1从门、纲、目及科分类水平上分析嗜盐古菌多样性 8
2.6.2从属分类水平上分析嗜盐古菌多样性 8
2.6.3从种分类水平上分析嗜盐古菌多样性 9
3.结论 12
4.讨论 13
致谢 14
参考文献 14
引言
在我们赖以生存的地球上有着各种各样的盐域环境，像是死海以及各种各样的盐湖等[1]，是自然的高盐环境，还有晒盐场、盐腌制品等这样人工形成的高盐环境[2]。生活在如此高盐环境下的微生物主要有耐盐菌、嗜盐菌和一部分藻类等。环境中的盐浓度高低对耐盐细菌的生长代谢无影响，即其的生长代谢可以不依赖于盐浓度, 但是嗜盐菌就必须在一定的盐浓度下才能够进行生长代谢。据嗜盐菌对 NaCl 的需求程度，嗜盐菌被分为 3 类：NaCl 需求浓度0.2 mol/L~0.5 mol/L为弱嗜盐菌、NaCl 需求浓度0.5 mol/L~3.0 mol/L为中度嗜盐菌、NaCl 需求浓度2.5 mol/L~5.2 mol/L为极端嗜盐菌，嗜盐古菌占了极端嗜盐菌的大多数 [3]。
截至目前，在我国西部的新疆、内蒙古、青海、西藏等这些存在有大量盐碱地或者盐湖的省份已发现了非常多的嗜盐菌种属。 然而，这些被人们所发现的嗜盐菌大多生活于自然的盐域环境中[4,5]，对于人工环境尤其是盐田环境中的嗜盐菌，很少有人对其进行研究。我们国家东部沿海地区的大量盐田，每年产出大量食盐，嗜盐微生物对于盐田这种生态系统正常运作和良性循环以及盐业的正常生产方面起着不可替代的作用。吕爱军等人曾经对连云港台南盐场嗜盐细菌和耐盐细菌的数量分布情况及其随着季节改变的变化的规律进行过研究[2]，但是盐田这样的盐域环境中的嗜盐古菌的种属和数量情况还少有人对此进行详细的研究和鉴定。
自上个世纪80年代以来，我们国家的科研工作者已经对嗜盐古菌做了大量的研究工作，发现了不少嗜盐古菌新种属，并对嗜盐古菌需要高盐环境并能生存下来的生理机制进行了阐述。嗜盐古菌能适应极端高盐环境的原因是靠其独特的生理结构以及独特的代谢机制[6]，嗜盐古菌通过紫膜中的视紫红质（bacteriorhodopison）这一特殊的代谢产物[7]，通过质子泵效应将光能转变为化学能，供其生长代谢[8]。
随着对嗜盐古菌研究的不断加深，嗜盐古菌研究的重要性也不断凸显出来。在医药、化工等方面[9]，嗜盐古菌的特殊代谢产物有着广泛的应用前景和研究潜力。另外，古菌域作为三域学说中重要的一环，由于其可以在极端恶劣的环境中长期生存下来，由此而演化形成的相适应恶劣环境的特定细胞结构[10]、相适应的特定的生理功能和与环境相适应的遗传学特性等[11-13]对于弄清生命起源与了解物种进化路径等有着不可替代的作用[14]。
但是，目前对于像盐田卤水这样的水环境中微生物的多样性研究，大多数仍旧是采用传统的纯培养方法，然而这一方法最大的局限性就在于环境中只有极少数的微生物具有可培养性，有研究称是只有1%[15]。因此，通过传统的纯培养方法是不能分离得到那些不可培养的微生物的，也就是说传统纯培养方法不能全面了解水样环境中微生物的多样性。得益于由科技发展所推动的现代分子生物学，运用生物发光的原理[16]，采用454高通量测序技术来对水样环境中的序列进行分析。对比于第一代只有几十或一两百个测序量的Sanger测序法[17]，454高通量测序技术作为第二代测序技术，一次能测上万条序列。通常至少对几万条序列进行测序，才能全面研究水样品中的微生物组成情况 [18]，运用454高通量测序就大大提高了的测序结果的准确性和可靠性。第二代测序技术454高通量测序技术由于其本身所具有的高通量、低成本、自动化这些相较于第一代测序法的优越性而越来越被广大科研工作者认可和被广泛采用[16]。
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