水稻ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 1 （APO1）/ ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 2（APO2）互作基因(2)
目 录
摘要 2
关键词2
Abstract2
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 4
1.2.1水稻幼穗蛋白提取4
1.2.2水稻DNA粗提4
1.2.3 iTRAQ4
1.2.4 GO分析5
1.2.5 酵母双杂5
1.2.6 CRISPR/Cas95
2 结果与分析 6
2.1 APO1与APO2/RFL基因对水稻穗型的影响6
2.2 与APO1和APO2/RFL互作蛋白的筛选9
2.2.1 iTRAQ筛选9
2.2.2 酵母双杂10
2.3 CRISPR/Cas9构建突变体及突变体检测10
3 结果与讨论11
致谢11
参考文献12
水稻ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 1 （APO1）/ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 2 （APO2/RFL）互作基因突变体的构建和功能分析
引言：水稻是三大粮食作物之一[1]，是很多国家，尤其是亚洲国家的主粮[2]。水稻穗部性状在产量结构中起到比较重要的作用，在穗部性状中，又以二次颖花对产量的影响更大[3]。水稻穗分化与最终产量的关系极为密切，不少研究者专注于此。当下通过传统栽培手段继续提高产量的空间有限，发掘新的基因及其功能的意义尤为重大。
水稻花序属于总状花序，水稻花序结构是由一次枝梗数和二次枝梗数决定的[4]。由于花序结构与作物产量存在密切关系，因此对与花序结构相关基因的研究一直在进行。分子遗传学方法已确定了多个参与控制花序结构的基因。过去的二十余年中，发现许多花分生组织特征基因，如LEAFY（LFY）/ FLORICAULA（FLO），APETALA1（AP1）/荔枝（SQUA），花椰菜（CAL），FRUITFULL（FUL）等[5—10]。在拟南芥中，几个在生育阶段调节分生组织的基因已经被鉴定。FLOWER1（TFL1）通过以抑制 LEAFY（LFY）和APETALA1（AP1）在花序顶端的表达，抑制花序分生组织过早转化；相反，LFY和AP1抑制TFL1在花序侧生分生组织中的表达[11]。
在花分生组织产生以后，会存在三种基因的表达，即Coen等人于1990年提出的经典ABC模型。A、B、C三类基因中有一类缺失，就会导致花器不正常发育（UFO）[12、13]。A类基因由AP1和AP2基因编码，控制第一轮和第二轮花器官的特性。A类基因功能的缺失会导致第一轮产生心皮而不是萼片，第二轮产生雄蕊而不是花瓣。B类基因由AP3和PI基因编码，控制第二轮和第三轮花器官的特性。B类基因功能的缺失会导致第二轮产生萼片而不是花瓣，第三轮产生心皮而不是雄蕊。C类基因由AG基因编码，控制第三轮和第四轮花器官的特性。C类基因功能的缺失会导致在第三轮产生花瓣而不是雄蕊，第四轮产生新的花。该模型认为每一轮花器官的形成都是三种类型花器官特性基因形成独特的组合决定的。此外，该模型还进一步认为A类基因和C类基因的功能拮抗。之后，Colombo等人发现了调控胚珠发育的D类基因[14]，以及花器官发育所必需的E类基因[15]。据此花发育模型修正为目前的“ABCDE”模型[16]。
研究者发现在APO1基因控制下，花序分生组织的小穗分生组织分化的小穗数量降低，并表现异常花器官[4]。在野生型的花序中，穗轴分生组织通常分化形成10-12个一次枝梗后才转化为小穗分生组织原基。然而，在apo1突变体中，枝梗分生组织在产生少量枝梗后就提前转为小穗分生组织原基。说明APO1基因的突变引起花序分生组织早熟[11]。Kyoko Ikeda等人利用基因和双突变体分析，证明APO1基因影响C类基因的表达，并在花期与FON1和FON2基因互作。所述apo1突变体的表型类似于金鱼草的cen突变体和拟南芥的tfl1突变体[11]。此外，APO1的缺失加快了水稻的出叶速率和调整了营养生长时间[4]。
APO1在诱导蛋白质泛素化降解中起重要作用。蛋白质的泛素化降解过程需要ATP的作用和E1、E2和E3酶的催化，生成单泛素化的底物蛋白，之后底物蛋白的泛素分子上48位Lys残基进一步泛素化，形成多聚泛素链。这样多聚泛素化的底物蛋白能够被26S蛋白酶体特异性识别、降解，生成单体泛素和多肽。而E3在泛素化过程中似乎起着关键作用[17]。CF复合体是研究最多的一种E3，F-Box是其中的一个组蛋白。APO1结构域包含一个F-Box结构域[11]，能够编码F-Box蛋白，诱导特异性底物蛋白与SCF复合体结合，再由26S蛋白酶体降解，起到调控蛋白表达的作用。但是哪些蛋白受到APO1基因调控，被APO1的F-box蛋白降解还有待研究。