水稻粉质突变体W9142突变基因的克隆和初步分析(2)
本研究通过筛选宁粳3号突变库，从中得到了一个粉质突变体W9142。通过图位克隆的方法，发现突变基因编码AGPase的一个大亚基，该基因的同源基因在拟南芥、玉米中也广泛存在[4]。本研究对W9142中基因OsAGPL2进行表达水平检测，探讨了W9142的突变机理，对该突变体的形态学特征和生理生化进行了初步的描述与分析。
1 材料和方法
1.1材料种植
突变体W9142是来源于宁粳3号的突变体。将W9142与籼稻品种Dular杂交、自交，构建F2群体，之后利用F2：3群体进行基因的精细定位和图位克隆。所有群体均种植在江苏省南京市土桥实验站，田间管理同大田生产。种子成熟以后，及时分单株收种，备用。
1.2实验方法
1.2.1 成熟种子直链淀粉、总淀粉和总蛋白质含量的测定
取野生型和突变体W9142成熟籽粒，用JLGJ4.5糙米机（浙江台州粮仪厂）制备糙米，用JNMJ3精米机（浙江台州粮仪厂）制备精米，去除种皮、果皮、糊粉层和胚。用JFS-13A粉碎磨（浙江台州粮仪厂）磨碎后，过100目米筛，制备米粉。
直链淀粉含量测定按照农业部标准NY147-88进行；总淀粉含量使用 Megazyme总淀粉测定试剂盒测定；总蛋白含量使用FOSS公司Kjeltee 2300型全自动凯氏定氮仪测定。每个样品重复三次，取平均值[4]。
1.2.2 成熟种子胚乳横截面扫描电镜观察
将野生型和突变体W9142成熟种子从中间部分横切制成样品后，在3％的戊二醛溶液中室温浸泡 3h，然后用0.1 mol/L 的磷酸钠溶液（pH=6.8）冲洗3~5次，每次进行15min。接着用2％的四氧化锇溶液在4℃下固定过夜，固定后的样品用0.1mol/L的磷酸钠溶液（pH=6.8）冲洗2~3次，每次15min，然后用70％、80％、95％、100％乙醇溶液逐级脱水，每次5min，再在乙醇－异戊基醋酸（体积比为1∶3）混合液中浸泡1h，取出干燥，最后用金粉包被，在日立S-3000N 型扫描电子显微镜下观察（加速电压为10~20KV）[5]。
1.2.3 W9142的图位克隆
在W9142与Dular的杂种F1植株上收取F2种子，挑选其中与W9142突变体一样表现为粉质不透明的F2种子，发芽后提取幼苗DNA 进行基因的精细定位。基因组DNA采用CTAB法提取[5]。PCR扩增反应体系如下：1μL DNA模板（约20ng），1μL 引物（0.2μmol/L），1μL dNTP （50μmol/L），1μL 10×缓冲液（含2Mg2+）和0.1μL Tap（5U/μL）DNA聚合酶（TaKaDa，大连），用ddH2O补足10μL。PCR程序如下：94℃下5min，94℃下30s，55℃下30s，72℃下40s，35个循环；72℃下10min，4℃下保存。PCR产物采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色[6]。
1.2.4 分子标记多态性筛选及定位分析
（1）多态性筛选：
利用本实验室的公共引物（表1）对Dular和W9142两个亲本进行多态性筛选，Dular带型记为“1”，W9142的带型记为“2”，将具有多态性的标记记录下来，用于下一步连锁分析和初定位。
（2）连锁分析：
将配制的W9142和Dular杂种F1上结实的种子磨成糙米，随机选取22个明显具有突变表型的糙米，将糙米催芽、浸种，然后种入土钵中，在培养箱内种植，提取苗期的DNA作为连锁分析的小群体，杂交组合的双亲Dular和W9142作为对照，用上述筛选到的多态性引物对这22个单株进行连锁分析。籼稻品种Dular的带型记为“1”，而突变体的带型记为“2”，杂合的带型记为“3”。聚丙稀酰胺电泳后，把不同引物的带型，记录下来进行分析。如果某个标记带型均为“2”，或者大多数为“2”，极少数为“3”；且其附近的标记带型均为“2”，或者大多数带型为“2”，极少数带型为“3”，则表明突变基因在该标记附近，该标记与基因有连锁现象，随后进一步扩大群体至46株验证是否与该标记连锁。