水稻低温发芽力的全基因组关联性分析 (2)
1．1 耐冷 QTLs 的图位克隆及分子机理 目前已被图位克隆的耐冷 QTL 有芽期的 qLTG3-1[1]、苗期的 Cold1[12]、成熟期的Ctb1[13]。qLTG3-1 是最早被克隆的芽期耐冷 QTL。Fujino 等[1]利用 ItalicaL 1700 ivorno/Hayamasari 构建的 RILs 初步定位群体，在第 3 号染色体上定位到一个与发芽率相关的主效 QTL（qLTG3-1，R2=35.0%） 。研究发现，qLTG3-1 编码一个未知蛋白，其表达不受低温诱导；浸种一天后在种皮糊粉层和覆盖胚芽鞘上胚层表达，调节细胞液泡化引起的组织松弛，提高种子低温条件下的发芽势[14][15]。Cold1 是利用日本晴/93-11 的 RILs 群体图位克隆的第一个苗期 QTL，与抽穗期花粉育性相关的 Ctb2位于同一个区间内[12]。基因表达产物为 G 蛋白信号调控因子，亚细胞定位在细胞质膜和内质网上，能与 G 蛋白α亚基互作激活 Ca2+通道传递放大冷信号。Cold1 起源于中国野生稻（Oryza rufipogon） ，基因内第四个外显子的第 15个碱基在野生型日本晴中为‘A’，而冷敏型感品种 93-11 为‘T’，相应的氨基酸由‘蛋氨酸’转变为‘赖氨酸’，导致耐冷型品种细胞膜周围的 Ca2+浓度在冷处理前后的出现显著变化，形成低温信号并提高 G 蛋白 GTP酶活性，进而激活下游的耐冷基因表达使植株获得耐冷特性。水稻孕穗期较营养生长期对冷害更加敏感，低温引起配子体不育可直接导致粮食减产。Saito 等[13]利用 Norin-PL8/Silewah构建的近等基因系在第4号染色体长臂上定位到一个孕穗期花粉育性相关的主效 QTL（Ctb1） ，在被精细定位至 17kb 范围后，该区间内仅有两个候选基因（F-box 蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶） ， 转基因功能验证 F-box 蛋白为 Ctb1 候选基因，在幼穗中高表达。Ctb1 与 E3 泛素连接酶亚基 Skp1 互作形成泛素-蛋白酶体参与孕穗期低温条件下正常花粉的形成，过表达的转基因植株花粉育性提高、花药长度显著增长[16]。
1．2 水稻耐冷性鉴定方法 水稻的低温冷害遍布整个生育期，但水稻产量主要形成期的耐冷性在农业生产中尤为重要，故水稻耐冷性的鉴定与研究主要集中在芽期、苗期和孕穗期，其中，芽期又分为发芽期和芽期。 水稻发芽期耐冷性，又称为低温下的发芽能力，低温下水稻种子的发芽所需天数、发芽指数、发芽率以及达到某一发芽率所需天数是评价水稻低温下发芽力的重要指标。目前在观察记录水稻种子前，需先以高温处理种子 48 小时，破除种子休眠，同时进行消毒、浸种。随后在一定低温下，如 15℃环境下放置一周以上，记录其发芽种子个数及计算发芽率[17]。
1．3 全基因组关联性分析原理 二十一世纪以来，DNA 测序技术自动化程度和基因分型通量的日益提升，研究人员能够同时对每一个个体上百万个 SNPs 进行检测，并处理海量的分型数据[6]，全基因组关联分析在人类和动植物基因组中的研究变得越来越广泛。 全基因组关联分析主要选择群体中的多个分子标记，例如大量的单核苷酸多态性（SNPs）标记作为对象，在其中进行筛选，随后对得到的分子性状和表型之间进行关联性分析，确定它们之间的遗传变异关系，这种方法使得多次世代前发生的基因重组也能作为标记加以利用[18]。 整个分析过程建立在群体层面中分子标记与复杂性状基因间的连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）上。连锁不平衡（LD）是指在某一群体中，不同座位某两个等位基因出现在同一条染色体上的频率高于预期的随机频率的现象。在生物进化过程中，基因突变、漂移以及选择都会产生连锁不平衡，而基因重组会打破连锁不平衡。在染色体上非常接近的基因位点会表现出较为牢固的连锁不平衡现象，同时群体结构越庞大，在染色体上相距同样距离的位点连锁不平衡越脆弱[19]。 连锁不平衡中重组距离决定了标记一条染色体所需要的遗传标记的个数，此外，群体中发生了分离的变异数量远远小于标记数[20]。为了能利用连锁不平衡来定位基因，使用群体关联性分析进行精确定位可以使突变位点和连锁标记之间的连锁更加紧密，然而精确定位依然依赖于一些对家系进行连锁分析时得到的原始基因组位点。为了解决这个问题，Rish 和Merikangas[21]提出了针对整个基因组进行完整的分析，在分析了包含 100万个变异位点的基因组以及来自无关个体的单个样本后，他们证实了：相比仅仅对几百个标记位点进行连锁分析，这种方式更加高效。