吡虫啉对马铃薯甲虫nAChR基因表达量的影响(2)
1材料与方法1.1.供试昆虫马铃薯甲虫幼虫于 2016 年采集于尼勒克、察布查尔县试验基地生长期马铃薯苗上。采集的马铃薯甲虫在马铃薯苗上饲养。饲养室条件：相对湿度 50%-60%、温度 26（±1）℃和光周期 16L:8D。 分别用 0.044μg/头、 0.022μg/头、 0.011μg/头、 0.0055μg/头、 0.0028μg/头、0.0007μg/头、0.00035μg/头的吡虫啉处理马铃薯甲虫 4 龄幼虫，将处理试虫冻存样品，运回南京进行后续试验。
1.2 主要试剂和仪器TRIzoI 总 RNA 提取试剂盒、Superscript III 反转录试剂盒、Clontech TM Smarter 试剂盒、TAKARATM M-MLV反转录试剂盒、La-Taq DNA 聚合酶、r-Taq DNA、Ex-Taq DNA聚合酶购自 Takara 公司、荧光定量试剂盒 SYBR ® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)、引物由南京英俊生物工程技术服务有限公司进行合成；ABI 7300 实时 PCR 系统(AppliedBiosystems 公司)、制冰机 SIM-F 124 旧本 SANYO 公司)、A2 型生物安全柜 1285(美国T'hermo Electron 公司)、超低温冰箱FORMA 906(美国 Thereto Electron 公司)、Nanodrop核酸定量仪、离心机 Centrifuge 5424
1.3 总 RNA 的提取用 TRIzoI 试剂提取马铃薯甲虫的总 RNA，步骤如下:（1)取马铃薯甲虫 4 龄幼虫，置于匀浆器内，加入适量液氮进行研磨，研磨彻底后再加入 1ml的 Trizol试剂匀浆，将其转入新的进口 1.5 ml Eppendorf 管中。
（2) 12,000 g 4℃离心 15min，离心完成后小心吸取上清液，移入新的进口 1.5 mlEppendorf管中（切勿吸取沉淀）。（3)在室温下温育上清液 5 min后，向其中加入氯仿 0.2 ml，盖紧离心管盖，剧烈震荡约 15Sec，再将其在室温下温育 10 min.（4)12,000 g 4℃离心 15min 后，混合物分层,上层为无色的水相，RNA溶在其中。用移液枪将水相转移入新的进口 1.5m1 Eppendorf 管中，接着向管中加入 0.5 ml 异丙醇沉淀RNA，温柔混匀，在室温下静置 10 min.（5) 12,000 g 4℃离心 15min，迅速弃掉上清液。向其中加入事先配置好的75%的乙醇1 ml 以清洗沉淀样品。然后涡旋振荡样品，使之与管壁分离后，7500 g 4℃离心 5min.（6)倒掉上清液，吸掉水分，平放于超净台或真空条件下将其干燥 10 min，加 30μl的去 RNA-free水，用枪头轻轻吸打混匀后，置于-70 ℃贮存备用
。1.4 cDNA 第一链的合成(1)反应体系：总 RNA 5μl, Oligo dT18 引物（500μg/ml）2μl，超纯水3μl。混匀后 70℃温育 5min, 0℃冰浴 10min.(2)再依次加入试剂：5 X 缓冲液 4 μl、dNTP(2.5 mM) 4 μl、 RNasin(40 U/μl）1 μl、M-MLV反转录酶(200 U/μl）1 μl，混匀后短时间离心。(3)将混合体系在PCR仪中完成 cDNA 合成：42℃ 60min, 95℃ 5min, 12℃保持。合成的 cDNA -20℃保存。1.5 荧光定量 PCR 反应分别将吡虫啉不同处理的马铃薯甲虫幼虫提取总RNA，反转录为 cDNA 模板后，采用ABI 7300 实时 PCR系统，以 SYBR Green 为染料，测定马铃薯甲虫 nAChR 亚基基因的相对表达量。为了缩短反应时间，采用了两步法进行 PCR，总反应体系20 μl.按下列组份配制 PCR反应液(在冰上进行):根据 SYBR ® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time), Takara 试剂的试验指南:PCR体系 20μl 如下:SYBR Premix Ex Taq(2×) 10μlPrimer-F 1μlPrimer-R 1μlcDNA 1μlROX Reference Dye(50×) 0.4μlSterile deionized H2O 6.6μl总体积 20μlPCR 程序为: 温度 95℃，时间 30 sec，进行如下循环: 95℃ 5sec，60℃ 31sec，循环数为 40; 95 ℃ 15 sec，60℃ 1min，95 ℃ 15 sec，60℃ 15 sec.每个反应重复数至少为 3.1.6 数据处理本研究采用 2—△△Ct的计算方法，即通过阀值（Ct）测定目标基因的表达量。计算公式为：△△Ct=（Ct目的基因Ct 内参基因）实验组（Ct目的基因Ct内参基因）对照。利用统计分析软件 SPSS 17.0 进行单因素方差分析，用 Turkey 法进行多重比较，从而检验比较目标基因在不同剂量吡虫啉处理后马铃薯就甲虫中表达量的差异。