牛T1R1基因的克隆及其组织差异表达分析(2)
2.2 T1R1 9号特异性目的片段的回收 13
2.3提取质粒测序 14
2.4 Q-PCR检测差异性 14
3讨论 16
3.1相关实验方法的改进探讨 16
3.1.1奶牛各组织总RNA的提取、检测 16
3.1.2实时荧光定量PCR 16
3.2实验结果的分析与讨论 16
引言
由于哺乳动物在摄取氨基酸的过程中部分微生物参与了降解，并且其氨基酸代谢调控的水平受到生理状态、生产性能的制约，因此无法准确测定氨基酸的需求量[1]。其中理论上最关键的是氨基酸的吸收调控机制还没有完善。
近几年的实验研究证实，氨基酸受体能够识别特异性的氨基酸[1]。T1R 受体包括 T1R1、T1R2、T1R3这三个基因。对突变体的研究证实氨基酸、IMP能与T1R1细胞外的不同位点结合为各种结构域[2]。T1R1+T1R3 能识别鲜，也是 L-氨基酸的受体，IMP 和 GMP 赋予其丰富的生物能[3]。
人们在研究动物觉细胞的分子机制中发现 T1R1 / T1R3是一个至关重要的哺乳动物氨基酸探测器，归属于 G 蛋白偶联受体[4]。此受体是最早的为可用氨基酸提供能量感知机制的G蛋白偶联受体[5]。哺乳动物T1Rs基因家族共有 T1R1、T1R2、T1R3这三类基因，早期认为它们主要在舌的觉感受器中表达，主要参与甜和 L 型氨基酸的识别[6]。
GPCR是一个关键的氨基酸感受器，在敲除GPCR的海拉细胞系中会导致MTORC1的负调控，哺乳动物MTORC1抑制剂复合体含有有效的氨基酸营养信息以帮助蛋白质的合成和细胞生长发育[7]。数项观察结果表明细胞尝试弥补在氨基酸受体敲除后感知能力的缺陷，细胞表达产生T1R1 / T1R3最初被认为是限制觉神经元的生长，因为大多数细胞类型需要氨基酸功能协调细胞可用的营养要求,T1R1 / T1R3可能作为一种氨基酸传感器在其他细胞类型。我们发现T1R1和T1R3广泛存在于老鼠组织,人类的胰岛,并且许多的细胞激活生长因子的mTORC1都需要氨基酸的存在[7-8]。
哺乳动物T1Rs 受体基因家族的 T1R1 基因和在识别特异氨基酸方面发挥着重要作用。近几年的许多实验都证明 T1R1 基因除了在觉细胞中含量较高，在其他组织中也存在，并且是以异二聚体的形式参与调控和识别，对氨基酸的吸收有着重要作用[8]。
目前对于T1Rs的研究多集中于单胃动物上，对牛的T1Rs受体家族的研究还很少[9]。其中的T1R1受体就是一种至关重要的哺乳动物氨基酸探测器，归属G蛋白偶联受体。此受体是最早的为可用的基本氨基酸提供能量感知机制的G蛋白偶联受体。通过分析T1R1基因在奶牛不同组织中的表达情况，可以更进一步的研究T1R1受体的多种功能，特别是在乳腺、肌肉和舌头上的组织差异性表达分析可以揭示如何提高乳腺组织的泌乳量，提高饲料利用率提供理论依据[10]。为此，本文以RT-PCR克隆了奶牛各组织中的 T1R1 基因片段，并以实时荧光定量PCR的方法对其组织特异性表达的情况作了初步分析。
1材料与方法
1.1实验的材料
1.1.1试剂
本实验所用到的试剂主要有：琼脂糖、EDTA、Tris、溴酚蓝、硼酸、4S Red Plus核酸染色剂（10000×水溶液）、DEPC、NaOH、DL2000、NaCl、氯仿、异戊醇、KCl、氨苄青霉素、牛肉膏蛋白胨、 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RnaseH Plus）、RNAiso、无水乙醇、ROX Reference Dye Ⅱ、Taq DNA聚合酶等。
1.1.2 试剂盒类
Trizol 总 RNA 提取试剂盒：宝生物工程（大连）
PMD19-T simple vector提取试剂盒：宝生物工程（大连）
San prep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：生工生物工程（上海）
上一篇：上海市屋顶绿化景观现状调研及评价