表达鸡法氏囊病毒VP2蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建及其免疫效力的研究(3)
枯草芽孢杆菌广泛存在于土壤和动物胃肠道，因其易于分离培养，具有较清晰的遗传背景和良好的分泌性，又无致病性等特点，已成为生物技术基础研究和应用研究中使用较多的重要菌种，而且，枯草芽孢杆菌作为益生菌和饲用酶产生菌越来越多的被应用于畜禽生产中。潘康成等[18]采用ERIC-PCR和PCR-DGGE对比检测肉鸡口服芽孢杆菌Pab02后肠道菌群结构的多样性的变化，证明了肉鸡口服枯草芽孢杆菌Pab02后可以提高肠道菌群的丰度和种群密度。栾超[19]利用SUMO融合技术在益生菌枯草芽孢杆菌菌株WB800N中重组表达并制备了具有活性的抗菌肽Cathelicidin-BF (CBF)，发现了重组抗菌肽CBF能有效缓解大肠杆菌K88感染对小鼠造成的损伤，为新型抗菌制剂的研发奠定了一定的基础。
因此，构建法氏囊病毒的表面蛋白VP2载体，将其在枯草芽孢杆菌上表达，通过口服免疫雏鸡，预测可以有效提高雏鸡对法氏囊病毒的免疫效力。
此外，益生菌抗原递送载体在黏膜免疫中的应用还有很多。由于细菌性活载体疫苗具有培养方便，外源基因容纳量大，刺激细胞免疫力强等优点，并具有巨大的应用潜力。细菌载体本身就起佐剂作用，剌激产生强的细胞和细胞免疫应答。口服细菌性活载体疫苗还能刺激黏膜免疫，且不像其他疫苗需要注射，因此用它作载体更具有吸引力。以细菌为载体的疫苗比重组载体病毒活疫苗的研究难度更大，但近年来在构建多价疫苗方面已取得相当大的进展，如把志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希氏菌的抗原基因导入沙门氏菌表达，猪繁殖与呼吸综合征病毒和蛋白重组结核分支杆菌疫苗等。
那么对于本研究的目标病毒—IBDV这个病毒的研究，早在1985年，Asad等[20]首先对澳大利亚002—73株IBDV的基因组进行了全面的研究，首次构建了IBDVcDNA基因文库。IBDV的核酸基因组含有两个片段分别称为A片段和B片段，两片段组成双链RNA分子。A片段长约3.1 kb-3.4 kb，包含两个相互重叠的开放阅读框架(ORF)，ORFA1约为3096 bp，ORFA2约为436bp，ORFA1和ORFA2的5端重叠编译VP5蛋白；同时ORFA1还编码一个约为110 ku的多聚前体蛋白(N-VP2-VP4-VP3-C) [21]，这个前体蛋白通过翻译、加工修饰之后，成为成熟的VP2, VP3和VP4蛋白。用于编码VP2蛋白的基因片段长约1362 bp，用于编码VP3蛋白的基因片段长约870bp，编码位于两者之间的VP4蛋白基因片段约810 bp。B片段长约2800—2900bp，含有一个ORF（2634 bp)，编码一个分子质量约97 ku(878个氨基酸)的VP1蛋白[22,23]，它是一种RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymeras,RdRp)。VP1的存在形式有两种，一种在病毒子内部与病毒基因组两个片段的dsRNA的J’端相连，另一种以游离多肽形式存在，主要参与基因组mRNA的转录和基因组负链RNA的合成[24,25]。由于VP2是病毒的主要结构蛋白之一，位于病毒颗粒的外表面，由A片段的5’端编码，分子量为3740 ku，占总结构蛋白的51%。VP2含有血清型特异性的能诱导产生中和抗体的构象依赖性(不连续)抗原决定簇[26,27,28]其诱导的中和抗体可保护宿主不受IBDV的感染，因此VP2是IBDV的宿主保护性抗原[29]。VP2在IBDV致病性上也起着决定性的作用。另外，VP2是细胞感染IBDV后引起细胞凋亡主要因素之一。所以本实验把VP2蛋白作为基因工程活载体疫苗的主要目的基因进行研究。
本实验所构建的基因重组活载体疫苗是以利用基因工程方法改造的细菌作为载体，将病原体的保护性抗原基因插入到改造过的递送表达载体内，得到可以表达法氏囊病毒VP2抗原的活疫苗。该类疫苗免疫动物向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免传统疫苗的很多缺点。活载体疫苗不但保护强毒的攻击，而且疫苗用量少，无需添加佐剂，成本低，免疫保护时间长，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。