葛根异黄酮的提取及其抗氧化性研究(2)
葛根异黄酮的传统提取方法是有机溶剂提取法[8]。但由于细胞壁的存在，葛根异黄酮不易溶出，提取率较低、提取效果较差[9]。为此，我们可利用纤文素酶（可使细胞壁发生不同程度的改变如软化、溶解等）结合超声波（可改变细胞壁的通透性）的方法提取葛根异黄酮，可以使葛根异黄酮更快的从细胞中提取出来，有利于有效成分溶出，提高葛根异黄酮的提取率[10-11]。
酶结合超声波法提取葛根异黄酮不仅可以节约时间，减少成本，更是大大增加异黄酮的提取率，这种方法可以大规模生产，给人带来给更大的利益。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
葛根、纤文素酶（50000 U/g）、无水乙醇、磷酸盐缓冲溶液（PBS；取磷酸二氢钾0.41 g、磷酸氢二钾5.59 g，加水令其溶解并使容量到500 mL）、邻苯三酚、Fe3+溶液
1.2主要仪器
LH高速万能粉碎机 上海浦江仪器有限公司
YL334电子天平 北京永兴科技仪器有限公司
LK-S8恒温水浴锅 巩义市予析仪器有限公司
ZQ3800型超声波清洗器 江苏超声仪器有限公司
IH-4700型紫外可见分光光度计 上海元华仪器有限公司
1.3 方法
1.3.1葛根异黄酮的提取
将葛根洗净，切片、干燥、破碎后，过80目筛，得到葛根粉，保存备用。
取葛根粉1 g，加入一定体积的乙醇溶液后，添加一定比例的纤文素酶，处理一定时间后，再进行超声波提取。提取结束后，于3000 r/min离心15 min，所得的上清液即为提取液。
1.3.2葛根异黄酮的测定
精确称取葛根素5.0000 g，用95%乙醇溶解并定容至100 mL，制得葛根素的标准液。分别吸取标准液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL分别置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，以95%的乙醇作为空白对照，于250 nm处测定吸光度度值A[12]。以葛根素浓度为横坐标、吸光度值作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=14.970x+0.1093（R2=0.9786）。
1.3.3葛根异黄酮的提取率的计算
葛根异黄酮提取率（%）=提取液中的葛根异黄酮含量（g）/葛根粉的质量（g）×100%。
1.3.4试验设计
固定纤文素酶解条件，通过单因素试验，研究料液比、超声时间和乙醇体积分数对葛根异黄酮提取率的影响；在单因素实验的基础上，采用正交试验确定出最佳的超声波提取条件。
固定超声波提取条件，通过单因素试验，研究酶解温度、酶用量和酶解时间对葛根异黄酮提取率的影响；在单因素实验的基础上，采用响应面试验确定出最佳的酶解条件。
1.3.5葛根异黄酮抗氧化性的测定
1.3.5.1对超氧阴离子的清除作用
葛根异黄酮对超氧阴离子自由基(O2-)的清除作用可采用邻苯三酚自氧化法[13]。用100 mmol/L的HCl溶解邻苯三酚，并定容至于25 mL，得到2 mmol/L的邻苯三酚储液（避光保存），临用时将储液以双蒸水稀释至0.2 mmol/L邻苯三酚供试溶液。
加入0.05 mol/L PBS缓冲液（pH=8.2）4.5 mL，25 ℃恒温水浴20 min，分别加入0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL试样和0.4 mL 2 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴反应5 min，然后定容50 mL，于波长250 nm处测定吸光度A1。以同样体积的蒸馏水代替样品所测的吸光度值为A0。以蒸馏水作参比溶液，重复3次。O2-清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100。