本实验通过比较不同薯色甘薯的IbC4H基因的序列差异，以分析该基因与薯色的关系。以不同薯色甘薯的叶片为实验材料，先用CTAB法提取叶片中的总DNA[11]，并对其进行DNA浓度测定，再以提取的DNA为模板，进行PCR反应扩增C4H基因的部分序列，然后与T载体连接后转化感受态大肠杆菌，在LB培养基上培养，挑选阳性菌落进行测序，再通过DNAman软件对测序的结果进行分析，比较不同薯色甘薯的IbC4H基因序列的差异，分析各个突变位点的变化情况，并将其翻译成对应的氨基酸，分析对应氨基酸性质的变化。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

白薯品种徐薯22号（Xu22）与徐薯28号（Xu28）、紫薯品种徐紫薯1号（XZ1）与徐紫薯3号（XZ3）

PCR反应仪、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、水浴锅、电泳槽、超净工作台、移液枪等

三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、10mM NaAc、TE buffer（pH8.0）、RNase、酚

2xCTAB（十六烷基三甲基溴化铵）：CTAB 20g、NaCl 81.9g、1M Tris-HCl 100ml、0.5M EDTA 40ml 加水至1L。

1M Tris-HCl：Tris 121.1g、H2O 800ml、浓HCl 42ml 调节pH至8.0后加水至1L。

0.5M EDTA：EDTA·Na·2H2O 86.1g、H2O 800ml、NaOH 20g调节pH至8.0后加水至1L。

KOD-Plus-Neo、10xPCR Buffer for KOD-Plus-Neo、dNTP、25mM MgSO4、引物（CR1386、CF94）、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、载体（pMD18-T Vector）、感受态细胞（E.coli DH5a Competent Cells）、X-Gal、IPTG、2×Taq Master Mix

LB培养基：胰蛋白胨 10g、酵母浸出液 5g、NaCl 10g、AGAR 15g 加水至1L调节pH至7.2—7.4。

10xTAE：Tris 48.4g、Na2EDTA·2H2O 7.44g、冰乙酸 11.42ml加水至1L调节pH至8.3。

2.2 CTAB法提取总DNA

①取出事先剪下的植物叶片置于研钵中，用液氮研磨至细粉状，将粉末装入50ml离心管中

②在离心管中加入65℃预热的2xCTAB 5ml，65℃水浴45min，间或搅拌

③水浴结束之后取出离心管，在高速冷冻离心机上离心，16℃，13000r/min，离心25min。用三氯甲烷∶异戊醇=24∶1的溶液进行平衡

④将离心后的上清液倒入干净的10ml离心管，加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇溶液混匀，轻摇30min，再次离心，16℃，13000r/min，离心25min。

⑤吸出上清液，重复上一步步骤

⑥吸出上清液到10ml的干净离心管中，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇（沿管壁慢慢加入，加完后立即混匀），然后用钢针轻轻搅拌，使DNA沉淀成团，并移至1.5ml离心管中

⑦用75%乙醇，10mM NaAc洗涤2次，16℃，10000r/min，离心5min，

⑧加入95%乙醇，进行离心，10000r/min，5min，16℃

⑨倒去乙醇，真空抽干，加入200μl pH8.0的TE buffer，使其溶解，全部溶解之后，加入适量的RNase37℃水浴，消化RNA 1h

⑩加入等体积的酚，摇匀后进行离心，10000r/min，10min，16℃

⑪吸出上清液，加入等体积的氯仿，摇匀后再次离心，10000r/min，10min，16℃

⑫吸出上清液，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的NaAc，摇匀后离心，10000r/min，10min，16℃

⑬去除上清液，加入1ml75%乙醇摇匀后离心，10000r/min，5min，16℃

⑭去除上清液，晾干后，加入200μl TE buffer溶解。

2.3 基因片段克隆

将上述溶解的DNA进行浓度测定，并将其稀释至200μg/μl左右。分别以各品系的DNA为模板，扩增IbC4H基因。根据已知序列利用primer5设计引物，正向引物为CF94（CAGGGAGTGGAGTTCGGGT），反向引物为CR1386（GCAAGTAGGGAAGTTTATGGGTG）。 PCR反应体系如下表所示（表2-1）。反应条件：95℃预变性10 min； 95℃变性30s；56.2℃退火30s；68℃ 延伸30s，30个循环；68℃延伸10min；12℃保存。PCR反应结束之后，在PCR管中再加入0.5μl Taq DNA聚合酶，在PCR反应仪上72℃延伸，30min。