完整淀粉酶的SBD有三个作用：（1）可以使溶液中的酶与不溶性底物进行相互作用；（2）将底物运输到酶催化区域(CD)的活性位点；（3）特殊条件下它能使淀粉粒表面结构破坏[4]。有证据表明，SBD不管是整合到其它酶或是蛋白质里，都具有独立性且具有生淀粉结合功能 [5]。还有实验证明，没有与生淀粉粒具有结合能力的酶在与SBD的融合而可以与淀粉粒结合[5,6]。利用这些特点，SBD在生物技术中有以下几点的应用：（1）分离纯化生物活性蛋白。因为SBD的独立性和功能特性，而且淀粉有优良的物理性质和价格低廉的优势。（2）改良淀粉酶的理化性质。Chen等[7]利用黑曲霉糖化酶SBD与半乳糖苷酶融合从而增强了半乳糖苷酶与生淀粉结合能力。（3）SBD转基因平台技术。将一些淀粉亲和性低或没有的外源酶蛋白的基因序列与SBD结合，利用转基因技术可以把SBD融合蛋白转到作物中，在这过程中改变了淀粉生物合成途径、改变淀粉分子结构, SBD技术为淀粉成为蛋白的携带体成为可能。（4）益生菌食品领域。SBD技术已经可以产生出粘着性完全不相同的淀粉。

本实验以pTrcHisB-GASBD2质粒为基础，构建了两个原核表达载体pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4。

2 实验材料

2.1 菌株与质粒

大肠杆菌(Esherichia coli) DH5α菌株、pET28a质粒和 pTrcHisB-GASBD2质粒本实验室保存。

2.2主要购买试剂

Pfu DNA Polymerase、DNA markerIII购自南京天为生物公司；各种限制性内切酶购于大连宝生物公司；T4快速连接酶购自于MBI公司；DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自上海生工；其他化学试剂均为分析纯。

2.3主要仪器设备

PCR仪(Eppendorf)、高速冷冻离心机(Eppendorf), 凝胶成像系统(BIO-RAD )、超净工作台(苏州净化设备厂)、制冰机和超低温冰箱(SANYO )、台式冷冻离心机(Eppendorf)、培养箱、DYYIII型电泳仪和琼脂糖水平电泳槽(北京六一)、各种型号移液器、Eppendorf管若干、平板若干。

2.4自制试剂

TE ( pH=8.0)缓冲液、LB培养基(培养大肠杆菌用)、氨苄青霉素(Amp )、卡那霉素、苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：l)、质粒提取溶剂I、质粒提取溶剂II、质粒提取溶剂III、30%甘油、CaCl2（0.1mol/L）。源`自,优尔`.论"文|网[www.youerw.com

3 实验方法

3.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建

3.1.1 pTrcHisB-GASBD2质粒DNA的提取

 (1) 将含有pTrcHisB-GASBD2质粒的大肠杆菌菌种接种到含50μg/mL Amp 的LB平板上，37℃的条件下过夜培养14h；挑取平板上活化的单菌落接种到15ml含50μg/mL Amp LB液体培养基中，37℃下振荡培养约14h。

(2) 取1.5ml 培养物倒入Eppendorf管中，8000r/min离心1min，去除掉上清液，将离心管倒置在滤纸上数分钟。

(3) 往试管的菌体沉淀物中加入100µl 已在冰上提前预冷的溶液I，振荡完全使菌体分散混匀。

(4) 试管中加入200µl新鲜配制的溶液II，上下颠倒3次混匀，置于冰上4min 。

(5) 再加入150µl冰上预冷的溶液III，上下颠倒数次混匀后，试管中出现白色絮状沉淀，冰上放置4min 。

(6) 将上清液提取并加入450µl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀充分，8000r/min离心15min。

(7)上层水相转移到新的离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，4℃放置5min，l2000r/min离心10min，去除上清液。

(8) 加入70％乙醇lml洗沉淀，真空干燥机干燥lmin。

(9) 加入20µL含有RNase A的TE缓冲液溶解DNA， -20℃保存备用。