摘要:对重组蛋白GASBD(s) 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中的表达水平进行了SDS–PAGE分析,结果表明与未诱导的对照相比,四个重组蛋白都表达了。通过Ni2+–NTA亲和层析的方法对蛋白可溶性表达部分进行了纯化。将GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合进行定性分析,结果显示GASBD(s) 蛋白展现出很强的淀粉结合特性,同时还发现,GASBD(s) 蛋白与不溶性淀粉结合力随着融合蛋白中SBD串联重复数的增加而增强。57505

毕业论文关键词:重组蛋白,表达,纯化,淀粉亲和性

Abstract:The expression level of recombinant protein GASBD (s) in Escherichia coli BL21 (DE3) was analyzed by SDS- PAGE, the results show that compared with the control without induction, four recombinant proteins are expressed. The soluble part of protein expression  were purified by Ni2+–NTA affinity chromatography. The GASBD(s) protein combined with insoluble starch were qualitatively analyzed, the results show that GASBD(s) protein have a strong starch binding characteristics. It is also found that, the affinity of GASBD(s) protein binding to insoluble starch was enhanced with increasing numbers of GASBD in the fusion proteins.

Keywords:recombinant proteins,expression,purification,the affinity of binding to starch  

目   录

1 前言 4

2 实验材料 5

2.1 菌株 5

2.2仪器 5

2.3试剂 5

2.4 培养基 5

3 实验方法 5

3.1 重组蛋白的诱导表达与分析 5

3.2 重组蛋白的纯化 6

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳 6

3.4 GASBD(s)蛋白与不溶性淀粉结合的定性分析 7

4 实验结果 7

4.1 重组蛋白的诱导表达与分析 7

4.2 重组蛋白GASBD(s)的纯化 8

4.3 GASBD(s)蛋白与不溶性淀粉结合的定性分析 10

结论 11

参考文献 12

致  谢 13

1 前言

包括糖基转移酶类、糖苷水解酶类、多糖裂解酶类和糖酯酶类的碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZy) 是一大类很重要的酶,能够降解、修饰以及生成糖苷键。碳水化合物活性酶一般都是多结构域酶,通常是由两个或两个以上不同的结构域组成的。碳水化合物活性酶含有催化结构域和功能各不相同的其它结构域。其中碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-Binding Module, CBM)是碳水化合物活性酶中最常见、也是最重要的结构域。到目前为止,已发现69种CBM,分别被命名为CBM1,CBM2,…, CBM69[1]。在目前发现的69种CBM家族中,因为有些CBM家族具有与生淀粉结合的特性,所以这些结构域又被称为淀粉结合结构域(starch-binding domain, SBD)。

首先被确定的是黑曲霉糖苷酶的SBD结构,所以被认为是SBD结构的代表。淀粉结合结构域含有8个β折叠链,并且折叠链形成了两个主要的β折叠片。第一个β折叠片含有5条反平行的链,而第二个β折叠片则是由1条平行链和1对反平行的链组成的,C-末端和N-末端位于分子长轴的两端。这种排列形成了一种开放弯曲的β-桶状结构,N-末端与第7、第8条链形成环通过二硫键相连[2]。在各种不同的酶中SBD的结合位点是各不相同的。环状芽抱杆菌CGTase SBD和黑曲霉糖化酶SBD具有可以同时结合两分子的底物两个糖基结合位点。通过NMR研究发现,结合有β-环糊精(一个环状淀粉类似物)的黑曲霉糖化酶SBD的结构在位于SBD的两端有两个独立的结合位点,每一个位点都具有两个或三个裸露的芳香族氨基酸。这两个结合位点在结构和功能上都是不同的[3]。

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