毕业论文关键词：帕金森病； 斑马鱼； 突变型； 野生型； 基因测序； 探针； 原位杂交；

Keywords:  Parkinson's disease (PD) ；zebrafish ;  mutant ;  wild type ;  sequencing ;  probe ;  in situ hybridization;

引言 5

1. 斑马鱼的PD模型 5

2. RNA-seq技术 7

3. 原位杂交 7

3.1 实验原理 7

3.2 实验试剂 7

3.3 准备：胚胎获取与固定脱水 8

3.4 原位杂交（3-4天） 9

3.4.1 Day1：重新水化、固定、酶解、预杂交 9

3.4.2 Day2：探针杂交 10

3.4.3 Day3：探针回收与抗体孵育 11

3.4.4 Day4：显色 11

3.5 原位杂交结果图像采集： 11

3.6 过染脱色： 11

3.7 原位杂交后样本后续实验：冰冻切片 12

4. 结果 12

5. 讨论 14

5.1胚胎易破碎 15

5.2染色背景过高 15

5.3染色呈蓝绿色或无染色 15

5.4染色只在表面 15

6. 前景 15

参考文献 16

引言

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种最常见的神经退行性运动障碍疾病，该病的临床特征是静止性震颤，肌肉强直，躯体麻痹，随着年龄的增加症状逐渐加重，经多巴胺的前体左旋多巴(L-dopa)治疗后症状减轻。PD 的病理学特征为黑质致密部多巴胺能神经元缺失，以及在剩余的多巴胺能神经元中出现泛素阳性的Lewy小体[ ]。在年龄大于 50 岁的人群中，PD 的发病率大约为 0.30%[ ]。 

LRRK2的基因定位和克隆起始于日本的一个常染色体显性遗传的 PD 家系．通过对该家系进行全基因组扫描和单体型分析，将 PD 相关的基因定位于 12p11.2～q11.3 13.6cM 的区间内．这个 PD相关位点与已经发现的位点不同，是一个新的位点，被命名为 PARK8[ ]．随后，在两个白种人家系中进一步证实PARK8 位点与常染色体显性遗传的 PD相关[ ]．最后，在 PARK8 位点内的 LRRK2 基因中检测到与PD 连锁的突变，证实 LRRK2 是 PD的相关基因。LRRK2全称为 leucine-rich repeat kinase 2，其蛋白质多达2 527个氨基酸，包含 ANK、LRR、Roc、COR、Kinase 和 WD40 等多个结构域。在这 6 个结构域中，Roc表现为 GTP 酶活性，Kinase表现为 ATP 激酶活性．ANK、LRR、WD40 均是由重复结构组成的结构域，可介导蛋白质相互作用[ ]。COR的具体功能还不清楚，在 Roc所属的ROCO 蛋白质家族中总是与 Roc串联在一起。LRRK2结构的复杂性指示 LRRK2 具有多样的细胞生物学功能。近年来，LRRK2 的研究已取得了较大进展。