可以发酵生产柠檬酸的菌种众多,其中黑曲霉（Aspergillus niger）是目前柠檬酸大规模工业化发酵采用的主要菌种，最为广泛应用的为菌株N558及C-144-131。然而，A. niger能引起肺曲霉肿类疾病一直是柠檬酸生产中存在的重大安全隐患，且该菌在柠檬酸发酵过程易引起重金属污染等环境问题[2,3]，这些缺点限制了其在柠檬酸工业生产中的发展。解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种安全的（已经过美国食品及医药管理局认定）高产柠檬酸的酵母菌，在柠檬酸发酵领域具有独特而重要的地位。Y. lipolytica对低溶氧及重金属环境敏感性较低，因而可以直接利用粗原料及工农业废弃物发酵柠檬酸，此外，该菌简单的单细胞结构使其更易于被遗传改造[4]，以上优点赋予了Y. lipolytica在柠檬酸发酵产业中的巨大潜力，因而使得该菌在近年来受到广泛的关注。论文网

Y. lipolytica的柠檬酸生物合成的代谢途径如图1中所示。首先葡萄糖通过糖酵解转化为丙酮酸，后者在丙酮酸羧化酶的作用下通过固定CO2转变成草酰乙酸，草酰乙酸被转运到线粒体内通过三羧酸循环转变成柠檬酸和其他的有机酸[5]。丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase, 简称PYC）（EC6.4.1.1）作为胞内代谢碳流量的枢纽，在该过程中起着关键作用。在碳代谢过程中，很多中间产物被用于各种物质的合成而被消耗，这些被消耗的中间产物需通过添补反应来补充，以维持胞内正常代谢和进一步的物质合成，并由此影响有机酸的合成。在大多数异养生物中，添补反应主要通过PYC催化的羧化反应来完成。PYC是一种生物素依赖型四聚体酶，这表明包括柠檬酸在内的大部分有机酸的生物合成过程都需要生物素的参与。

玉米浆是玉米淀粉等产品加工过程中浸渍处理的主要副产物，经浓缩后固形物含量约70%左右。玉米浆成分较为复杂，除蛋白质含量较高以外（高于40%，按干重计），氨基酸、生物素和维生素（如烟酸等）含量也较为丰富，因此，作为一种良好的微生物生长或代谢产物合成的促进剂，玉米浆已被广泛应用于酶制剂、抗生素、生化药物等众多发酵产品的生产过程，同时，有报道称，玉米浆也是一种有机氮的极好来源[6]。目前，玉米浆已经在多种有机酸如乳酸、苹果酸和琥珀酸的发酵生产中作为氮源及生物素源[7~9]。此外，玉米浆作为一种经济的低成本氮源，在工业生产上代替昂贵氮源如蛋白胨和酵母提取物也颇具潜力[6]。

尽管玉米浆作为一种优良氮源被广泛应用，然而其应用于Y. lipolytica发酵柠檬酸还没有被详细研究过。在本实验中，Y. lipolytica SWJ-1b的液体深层发酵作为评估以玉米浆被作为有效氮源生产柠檬酸的一个模式方法，研究玉米浆对细胞生长，碳代谢流，柠檬酸以及副产物异柠檬酸生产的影响。而CaCO3作为中和剂加入培养基中，以维持发酵过程中pH稳定，同时为丙酮酸的羧化提供CO2。

图1 Y. lipolytica柠檬酸合成途径

PYC:丙酮酸羧化酶；PDH:丙酮酸脱氢酶；CS:柠檬酸合成酶；ACO:顺乌头酸酶

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

本研究中生产柠檬酸的Y. lipolytica SWJ-1b是从渤海的海洋鱼类的肠道中分离获得的。

2.1.2 原料

本实验所用玉米浆由淮安市百麦绿色生物能源有限公司友情提供。

2.1.3 培养基

固体YPD培养基：葡萄糖20.0 g/l，琼脂20.0 g/l，酵母粉10.0 g/l，蛋白胨20.0 g/l，在115 ºC，灭菌30 min。