本研究提取镉胁迫后的东南景天总RNA,构建其全长cDNA文库,然后将整个文库包装到改造后的植物双元表达载体pBI121GB,通过农杆菌介导的植物转化方法侵染拟南芥,获得转基因拟南芥,鉴定转基因阳性植株并克隆插入的cDNA,通过对插入基因的初步生物信息学分析为后续筛选耐镉突变体,获得东南景天耐镉相关基因提供分子资源。

2 材料与方法

2.1实验材料与试剂

2.1.1植物材料

矿山型东南景天:人工气候箱中土培,光照16个小时/黑暗8个小时,温度为25℃。100 umol.L-1CdCl2胁迫处理12h后用于实验。

拟南芥:拟南芥种子均匀播种于1/2MS培养基表面,用保鲜膜封好以保持湿度,4℃春化2天过后22℃光照条件下萌发,待种子萌发且幼苗长出两片子叶后,去掉保鲜膜,将其移入盛满培养土并用营养液浸透的边长大约12 cm的方形培养杯中,每杯载种四棵。植物放置在生长架上,温度保持在18-22℃,不能超过25℃,光照强度为150-300 uE平方米-1秒-1,长日照(16小时光照,8小时黑暗)条件下培养。[8]每两个星期,浇灌稀释的营养液,平时让土壤自然吸水,并适当喷洒农药以防止病虫害的发生。

2.1.2酶和主要试剂 文献综述

主要试剂:总RNA提取用试剂采用invitrogen公司的Trizol;利用Promega公司的 thePolyATtract®mRNA Isolation Kits来分离mRNA;反转录酶PowerScript Reverse Transcriptase选自invitrogen公司;AdvantageTM2 PCR Kit采用Clontech公司;DH5α电击感受态选自TAKARA公司;其它试剂均为国产或进口分析纯。

2.1.3菌株与质粒:

(1) 农杆菌菌株EHA105为中国林科院亚林所林木遗传工程组实验室保存。

(2) 质粒pBI121GB为中国林科院亚林所林木遗传工程组实验室改造保存。

2.1.4培养基

(1) 农杆菌培养基

YEP培养基:在950 ml去离子水中加10 g tryptone、10 g yeast extract、5 g NaCl调pH7.0后定容至1L。

YM培养基: 在950 ml去离子水中加KH2PO4 0.5 g、Mannitol(甘露醇) 10 g、C-Glutamine(C-谷氨酰胺)2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4 0.2 g、yeast extract 0.3 g,调pH7.0并加15 gAgar后定容至1 L,120℃灭菌,待降温到65℃以下,加入相应抗生素。

(2) 抗生素

利福平(Rif)贮存液的配置:称取0.5 g Rif,25 ml甲醇溶解,过滤灭菌,分装入无菌小管,-20℃冰冻保存,母液浓度为25 mg.ml-1

卡那霉素(Kana)贮存液的配制:称取1 g Kana,用蒸馏水直接溶解,并定容至20 ml,过滤灭菌,分装入无菌小管,-20℃冰冻保存,母液浓度为50 mg.ml-1

2.2实验方法来.自/优尔论|文-网www.youerw.com/

2.2.1东南景天全长 cDNA 文库构建

2.2.1.1东南景天全株总RNA抽提

(根据invitrogen公司的Trizol reagent 操作说明书进行)

取1g样品加液氮研磨,加入1 ml的 Trizol,室温放置5分钟;加入200 ul氯仿,用力震荡1分钟,冰浴20分钟;4℃,12000 rpm,离心20 min;从每管中吸取上清至另一1.5 ml eppendorf管,加入等体积-20℃预冷的异丙醇,混匀后-80℃沉淀过夜(沉淀RNA);4℃,13000 rpm离心20 min后,去上清;加入10 ml于4℃预冷的75%乙醇,洗涤沉淀及离心管壁;4℃,13000 rpm离心5 min,弃上清;加入适量DEPC处理过的水,至完全溶解,进行紫外分析测定;进行DNA酶消化,并紫外分析测定

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