干酵母

2.2  器材

分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液器、研钵、试管夹、锥形瓶、烧杯、移液枪。

2.3  试剂

蔗糖、标准磷酸盐溶液、磷酸盐缓冲液、3 mol/L硫酸和25 g/L钼氨酸等体积混合液、50 g/L三氯乙酸溶液、α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液。

3  实验方法  

3.1  标准曲线的制定

取6支试管编上号，按照表1的次序，向6支管内加入标准磷酸盐溶液、蒸馏水、钼氨酸-硫酸混合液和α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液。充分摇匀后放入37℃恒温水浴锅中加热10 min。其中α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液需要加一管保温一管，目的是使各管的无机磷和还原剂反应的时间严格一致。从水浴锅取出试管后冷却到室温，在波长为660 nm下测定吸光值。

表1  磷标准曲线的制作

管号 标准磷酸盐溶液/ml 含磷量/ug 蒸馏水/ml 钼酸铵-硫酸混合液/ml α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液/ml 37℃水浴保温10 min后冷却至室温 A660nm

吸光值

1 0 0 3.0 2.5 0.5

2 0.2 5 2.8 2.5 0.5

3 0.4 10 2.6 2.5 0.5

4 0.6 15 2.4 2.5 0.5

5 0.8 20 2.2 2.5 0.5

6 1.0 25 2.0 2.5 0.5

重复5次，取平均值，以含磷量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.2  酵母发酵

称取1g干酵母放入研钵中研磨，再加入1.5 ml蒸馏水混匀，放入零下20℃冷冻，冷冻时间为12 h，24h、36h、48h。冷冻后取出，立即敲碎，加入1 g蔗糖研磨，加入3.5 ml蒸馏水和5 ml磷酸盐溶液研磨均匀。研磨过后，将匀浆转移至50 ml的锥形瓶中，并且立即取出0.5 ml均匀的悬浮液，加入到装有3.5 ml三氯乙酸溶液的离心管中，作为样品1。在3000 rpm/min下离心10 min。将锥形瓶放入37℃恒温水浴锅中，每过30 min取出0.5 ml悬浮液，分别加入到装有3.5 ml三氯乙酸的离心管中[4]，在3000 r/min离心机下离心10 min。共取4次，分别作为样品2、3、4、5。

3.3  无机磷的测定

取6支试管，编号。按照表2依次加入样品，充分摇匀，放入37℃恒温水浴锅中保温10 min。α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液临用前稀释2倍，且加一管，混匀一管，保温一管。10 min后取出试管，在660 nm吸光值的分光光度计下测量吸光值，第6管作为对照。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com