赖脯胰岛素（Insulin lispro, IL）是人胰岛素（Human insulin, HI）B链C-末端28位上的脯氨酸与29位上的赖氨酸相互换位围成的胰岛素[4]。在II型糖尿病临床研究中表明，IL起效快(约15 min)，与HI (餐前30-45 min)相比，给药与进餐的时间间隔较短(餐前0-15 min)，且IL降低餐后高血糖效果优于HI[5-7]。赖脯胰岛素在II型糖尿病临床治疗上有明显效果，赖脯胰岛素促使人胰岛素B链被门冬氨酸所替换聚集，且以单聚体的方式被人体吸收，其代谢速度快、吸收快、可快速恢复基础代谢，有效的降低了II型糖尿病患者的低血糖发生率[8]。在赖脯胰岛素的药学研究中，等电点是其质量控制重要的指标，它可以反映出该类药物的纯度和空间构象的一致性以及生产过程的可靠性，因此等电点的准确测定在该类药物的研发中发挥重要作用。

等电聚焦电泳（Isoelectrofocusing electrophoresis, IEE）是由瑞典科学家Rible和Vesterberg建立的一种高分辨率的蛋白分析新技术[9]。在凝胶中加入的两性电解质是一组同系物，里面包含多羟基和多羧基，这种两性电解质是人工合成的[10]。受到高压电场的作用就会形成均匀的pH梯度，根据蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在含有载体两性电解质所形成的一个连续而又稳定的线性pH梯度中电泳，涌动到特定的pH位置时便停止，正负电荷相等而成中性，从而可将多肽蛋白质根据等电点分离开来测定其等电点[11]。IEE发展至今，由原来的柱电泳逐渐发展到垂直电泳，又发展到如今最先进的超薄型水平板电泳，该方法具有省时省料、分辨率高和易于分析等优点[12]，本实验正是采用超薄型水平板等电聚焦电泳，通过优化样品前处理条件，建立一种稳定测定赖脯胰岛素等电点的方法，为胰岛素以及胰岛素类似物等电点测定提供试验参数。文献综述

2材料和方法

2.1材料

2.1.1样品

赖脯胰岛素为高度纯化后的样品，由江苏万邦生化医药股份有限公司提供；赖脯胰岛素标准品由中国药品生物制品检定所提供（140729-200501）。

2.1.2试剂

甲醇、冰醋酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、盐酸（0.01mol/L）、磷酸（1mol/L）、氢氧化钠（1mol/L）均购自国药集团化学试剂股份有限公司，考马斯亮蓝R-250、单丙烯酰胺（ACB）、过硫酸铵（APS）、亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、牛血清白蛋白（BSA）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）均购自sigma，两性电解质（Ph3.0-10.0，GE-Healthcare Life Science）。

2.1.3仪器

凝胶支持膜（Gel Bond PAG film）、灌胶模(GE Healthcare)、电泳仪（Multi-phorII）、循环水浴(MultiTempIII)；全波长紫外可见光扫描仪(Nano Drop ND-1000)；真空冷冻干燥机(Creatrust)。

2.2方法

2.2.1样品的处理

赖脯胰岛素样品处理-1：分别称取赖脯胰岛素10 mg和20 mg，溶于500 ul 0.01mol/L的HCL，10000g离心5 min，取上清备用。

赖脯胰岛素样品处理-2：称取1 g赖脯胰岛素，加100 ml双蒸水，并加微量醋酸助溶，完全溶解后，冻干。分别称取冻干处理的赖脯胰岛素20 mg，溶于500ul 双蒸水，10000g离心5 min，取上清备用。

赖脯胰岛素样品处理-3：称取1 g赖脯胰岛素，加100 ml双蒸水，并加微量醋酸助溶，完全溶解后，冻干。分别称取冻干处理的赖脯胰岛素20 mg，溶于500ul 上样缓冲液，10000g离心5 min，取上清备用。

赖脯胰岛素标准品处理：称取1 g赖脯胰岛素标准品，加100 ml双蒸水，并加微量醋酸助溶，完全溶解后，冻干。分别称取冻干赖脯胰岛素标准品20 mg，溶于500 ul 上样缓冲液，10000g离心5 min，取上清备用。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com