手术工具：弯头镊、尖头镊、大手术剪、止血钳、小手术剪

试剂：生理盐水（0。9%NaCl）、多聚甲醛溶液（4%PFA）、戊巴比妥钠（1%）

（1）小鼠麻醉，先对小鼠进行称重，戊巴比妥钠注射量为1g/0。01ml。

（2）将麻醉后的小鼠四肢固定于泡沫底座上，用手术剪剪开胸口皮毛，剪断肋骨，用止血钳固定，暴露完整心脏。

（3）准备两个20 ml注射器，一个装满生理盐水，一个装满多聚甲醛溶液。灌注时，左心室进针，用手术剪剪开右心耳。先灌注生理盐水20 ml，保证肝脏变白并且流出液体由鲜血变为无色液体，再灌注多聚甲醛。多聚甲醛灌注量为30-40 ml，灌注成功可发现小鼠有明显僵直现象。

（4）剪去小鼠头部，使用弯头镊和尖头镊剥开小鼠头骨，将小鼠脑子完成无损地取出，放进4%PFA中固定4h，放于4℃冰箱。固定完成后，将小鼠脑子放进30%蔗糖溶液中脱水，4℃过夜，直至小鼠脑子沉到底部说明脱水完全。文献综述

1。 3。3 冷冻切片

（1） 调整切片机温度到-21℃，切片前将切片机内冻头温度调整到-25℃。

（2） 将小鼠脑子从蔗糖溶液中取出，并充分吸干水分。将脑子放进方形模具中，使用OCT进行包埋。包埋完成后将其取出固定于圆形冻头上，并将其放入切片机中等待包埋剂完全凝固。

（3） 将冻头固定好，开始切片，同时观察脑子位置是否正，若不正则及时调节。脑片切取厚度为30 m，放于1*PBS中4℃保存。

1。 3。4 免疫组化（Immunohistochemistry）

实验目的：免疫组化被用来观察神经系统结构，它可以通过使用位置、形态、基因或蛋白的表达来区分细胞以及观察和其他细胞间的关系。它通过可被观察的抗体来选择性标记某些细胞或组织中的目的抗原，从而观察到目的抗原。

实验材料：

0。9% 盐水 (1000 ml):

NaCl,    9 g

ddH2O:  Add to 1000 ml

4% PFA (Paraformaldehyde，多聚甲醛) (1000 ml)

PFA,          40 g

ddH2O,        870 ml

10M NaOH,     1。1 ml

1M Na2HPO4,   70 ml

1M Na2H2PO4,  30 ml

30% 蔗糖溶液(100 ml)

蔗糖,   30 g

ddH2O,   Add to 100 ml

0。1M PBS (phosphate-buffered saline，磷酸缓冲液) (1000 ml, pH 7。4):

NaCl,     80 g

KCl,      2 g

KH2PO4,   2。4 g 

Na2HPO4,  14。4 g 

HCl

ddH2O,    Add to 1000 ml 

PBST: 0。1 PBS containing 0。3% TritonX-100

5% Donkey serum (驴血清，用PBST稀释)

70% Glycerol (甘油，用ddH2O稀释)

Primary antibody (一抗，用PBST稀释并加入1%驴血清): Anti-5-HT (Goat Polyclonal, 1:250, ImmunoStar, 20079)

Secondary antibody (二抗，用PBST稀释并加入1%驴血清): Cyanine Cy™3-conjugated secondary antibody (Donkey Polyclonal, 1:500, Jackson, 705-166-147)

Leica CM1950, Olympus VS120

实验步骤：

（1） 用0。9%盐水和4%多聚甲醛先后灌注小鼠脑子

（2） 在4℃中用4%多聚甲醛固定脑子24小时

（3） 用30%蔗糖溶液对脑子进行脱水，至脑子沉底为脱水完全

（4） 在-23℃下用包埋剂（OCT）对脑子进行包埋

（5）