TAR 克隆使用的受体细胞主要是酿酒酵母细胞，经过多年的改进和发展，目前已经应用 于多个领域，结合一些基因工程操作方法，例如“插件和播放”的调控模式等，可以有效地发 掘酵母基因组中可用于合成新型代谢产物的大片段沉默基因簇[9]。利用 CRISPR/Cas9 等基因 编辑技术，还可以实现在酵母复杂的基因组中复制基因片段和染色体位点，为人类基因库的 建立提供了更好的方式，为基因治疗在诊断，基因置换和动物模型利用方面都提供了更多可 能性[10]。

然而，由于 TAR 克隆过程中需要同时将线性化的 TAR 克隆载体与片段化的基因组 DNA 同时导入酵母细胞中，极大的限制了转化效率。对此，本课题通过优化 TAR 捕捉载体构建及 I-SceI 诱导表达系统，使已经含有 TAR 捕捉载体的酵母细胞在感受态制备过程中诱导载体线 性化，用于直接转化基因组片段，显著提高了克隆效率。

1。3 CRISPR/Cas9 基因组编辑体系

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated Cas9）系 统是可用于各种复杂基因组编辑的第三代人工核酸内切酶。该技术目前在微生物、小鼠和斑 马鱼，甚至人类细胞的基因组修饰工作中都得到了成功应用，基于其特异性强，编辑效率高文献综述

以及系统构建简单等特点成为目前最热门的基因组编辑工具[14]。

最初的 CRISPR/Cas9 体系是从细菌和古细菌的基因组中发现的，细菌利用这样的体系可 以抵抗外源遗传物质的入侵，例如噬菌体的入侵，外源质粒的转移等。具体的运作机制如图 1。2 所示。

图 1。2  产脓链球菌 CRISPR/Cas9 抵抗外源遗传物质入侵示意图

CRISPR/Cas9 系统将入侵外源遗传物质的 DNA 片段整合到 CRISPR 体系中，然后利用 与之相对应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导 Cas9 酶蛋白对同源序列进行降解，使细菌获 得免疫性。随着对该系统认识的加深，科学家们发现了该系统在其他宿主中进行基因组编辑 的潜在价值，并认识到 Cas9 效应物核酸酶作为一种以 RNA 为导向的 dsDNA 结合蛋白，能 够对 RNA、DNA 和蛋白都进行定位，这使得 CRISPR/Cas9 系统拥有了巨大的改造潜力。同 时，研究表明，只需将无核酸酶的 Cas9 与蛋白融合后，并使 sgRNA 进行适当表达，该体系 即可靶定任何 dsDNA 序列，在此过程中，RN A 可连接到 sgRNA 的末端使得 Cas9 酶蛋白的 结合不受其影响。由此证明 Cas9 能对几乎所有 dsDNA 序列进行识别和编辑，为人工构建 CRISPR/Cas9 体系提供了方向[15]。

由于 CRISPR/Cas9  体系的 工作原理是 crRNA（CRISPR-derived   RNA）与 tracrRNA

（trans-activating RNA）通过碱基配对结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物后，由此复合物引导来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

Cas9 酶蛋白在与 crRNA  配对的序列靶点位置将双链 DNA 剪切开后使该 DNA 失效或对其进行修饰等。因而只需在原有 DNA 的基础上替换掉 20～30 bp 的核苷酸，即设计两对引物， 实现对这两种 RNA 的人工设计，改造形成具有导向作用的 sgRNA （short guide RNA），就 可以引导 CRISPR/Cas9 对 DNA 进行定点切割[15]。

CRISPR/Cas9 系统作为现今基因组编辑工具的研究热点，在基因定点突变、基因片段定 点插入、基因组小片段的缺失等方面都有其应用价值，同时在转录激活与一直，基因组结构 调控，表观遗传标记的调节等领域也发挥着独有的作用，为分子生物学和合成学提供了有效 的工具和体系，未来还会在遗传病治疗和药物开发调控中有更加广泛的应用[14]。

本课题首先利用含有博来霉素抗性基因的 DNA 片段进行方法测试，证明该策略的可行 性，并 进一步 克隆了 假单 胞菌中 的 syringomycin 基 因簇 。为了 提高 验证效 率， 还利用 CRISPR-Cas9 基因编辑体系插入了博来霉素抗性筛选标记，使该体系更加完整高效。