1。3。3 药用植物大戟ko基因的克隆及测序

    将取得的PCR 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，通过DNA胶回收试剂盒纯化回收，连接pEASY-Blunt Cloning Vector（Transgen），转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选选取，将取得带有目的片段的阳性克隆质粒测序，测序于上海生工完成[16]。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

1。3。4 生物信息学分析 

    通过NCBI 的ORF Finder 在线软件剖析大戟ko基因的开放阅读框（ORF）并获得氨基酸序列。采取ExPASy在线服务器的Compute Pi/Mw 工具估计测定氨基酸序列的相对分子质量与理论等电点（pI），PSORT 服务器预先测定蛋白质的亚细胞定位；通过ExPASy 在线服务器的GOR 软件估计测定二级构造（https://npsa-prabi。ibcp。fr/cgi-bin/npsa_automat。pl?pagenpsa_gor4。html）。通过protein blast寻找相近的序列，选择与药用植物大戟KO氨基酸序列相似性较高的不同来源的KO 氨基酸序列，运用ClustalW2 软件对这些氨基酸序列进行多序列对照[17-18]。

1。3。5 组织表达分析

    根据药用植物大戟ko基因的序列和ACTIN基因的序列设计引物如下：KOF2: 5’-CTCCGATTGTTCCTTTGCGATA-3’, KOR2: 5’-TTGTCCATGTTGCACCCGT ATA-3’, ACTF: 5’-CAATCCCAAGGCCAATAGGG-3’, ACTR: 5’-CAGCAAGGT CCAGACGAAGG-3’。以药用植物大戟根、茎和叶的cDNA为模板，参照TransStart Green qPCR SuperMix UDG说明书进行real-time PCR反应。每个样品重复三次。