由此我们推测,姜黄素可能通过影响XAF1基因表达而抑制HepG-2细胞增殖。本课题旨在探讨姜黄素对HepG-2细胞中XAF1基因表达的影响,并构建XAF1 基因反义干扰表达载体,该载体将为进一步深入研究XAF1基因在姜黄素抑制HepG-2细胞增殖中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1。1  实验材料

人肝癌HepG-2细胞由生命与环境科学学院提供。

DMEM 高糖培养基(Boster),新生牛血清(四季青),胰蛋白酶(EDTA,酚红,南京凯基),DMSO(Bio Basic),PBS,封口膜(Parafilm),Trizol(Beyotime),DEPC(BBI),AMV 第一链cDNA 合成试剂盒(Sangon),琼脂糖(BIOWEST,G-10),50×TAE(Sangon),溴化乙锭(EB,Sangon), pGreen-PourTM shRNA(Clontech),BamH1和Ecro1(TaKaRa),大肠杆菌DH 5α感受态细胞(TransGen Biotech),T4 DNA连接酶(Fermentas),GeneTran 转染试剂(Biomiga),EndoFree 质粒DNA 大量提取试剂盒(Biomiga),AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒、、姜黄素(BioBasic)。

移液枪、数显恒温水浴锅(DK-8D,上海精宏),THZ-C恒温振荡器(江苏太仓),CO2 培养箱(HF151,Heal Force),单人双面垂直净化工作台(VS-840-2,上海博讯),倒置显微镜(TS100,Nikon),全自动正置荧光DIC 显微镜及成像系统(90i,Nikon),分光光度计(Eppendorf,Biophotometer plus),水平电泳仪(Amersham Biosciences,EPS 301),凝胶成像系统(Tanon),电子天平(METTLER TOLEDO,PL203),常规PCR 仪(K960)。文献综述

1。2  实验方法 

1。2。1 细胞培养

细胞复苏:

将水浴锅预热至37℃,超净工作台紫外灭菌30min备用。从-80℃冰箱中取出装有HepG-2细胞的冻存管,迅速转移至37℃水浴中解冻,解冻过程中需不断晃动冻存管。待细胞悬液完全融化后,用75%的酒精对冻存管进行消毒,在超净工作台中打开冻存管上的封口膜,打开管盖,用移液枪将细胞悬液转移至含有3ml新鲜DMEM培养液(含10%小牛血清、1%青链霉素)的培养瓶中,将瓶盖适度拧紧,并将培养瓶置于37℃,5%CO2及饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。

传代培养:

用DMEM培养液(含10%小牛血清、1%青链霉素)贴壁培养人肝癌HepG-2细胞,当贴壁细胞密度达到90%以上时,即可进行传代。细胞培养和传代操作均在超净工作台中完成。细胞进行传代时,先将培养瓶中的培养液倒尽,用PBS洗两遍,再加入1ml、0。25%的胰蛋白酶溶液进行消化,密封后将培养瓶置于37摄氏度培养箱中孵化,直至在显微镜下可观察到所有细胞变成球形。将胰蛋白酶溶液倒尽,旋紧瓶盖后轻轻拍打培养瓶,使贴壁细胞脱落,然后加入5ml新鲜DMEM培养液,用枪头吹打至细胞悬浮液混合均匀。最后,按1:3的比例对HepG-2细胞进行传代培养。

细胞冻存:

当贴壁细胞密度达到90%时,消化细胞,加入10%小牛血清(培养液中已含10%的小牛血清),10%的DMSO溶液,混匀后用移液枪吸取1mL混合液移入灭菌后的冻存管中,拧紧管盖,用封口膜封好。将冻存管置于梯度冻存盒中,放入-80℃冰箱中保存。

1。2。2 细胞处理

将HepG-2细胞接种于含DMEM培养液的6孔板中,用20μM浓度的姜黄素以不同的时间梯度(0、3h、6h、12h、24h)处理HepG-2细胞。将细胞置于37℃,5%CO2及饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

1。2。3 Trizol法提总RNA

离心机预冷准备。将6孔板中的培养液吸干净,每孔中加入1mLTrizol试剂。用枪头划板1min使细胞充分裂解后移入PCR管中,用涡旋仪混合均匀。加入200μL氯仿,用涡旋仪剧烈混匀,置于冰上10min。随后4℃、12000g离心15min。离心后吸取上清液(不要将白色物质吸入)放入另一PCR管中,置于冰上,每管中加入500μL异丙醇(4℃预冷),轻轻混匀,放在冰上10min,再4℃、12000g离心10min。弃上层液,加入1mL70%乙醇(4℃预冷)混匀,4℃、7500g离心10min。弃上清液,将离心管倒置于干净的吸水纸上沥干,室温烘干5min左右,加入20μLDEPC水溶解。

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