由此我们推测，姜黄素可能通过影响XAF1基因表达而抑制HepG-2细胞增殖。本课题旨在探讨姜黄素对HepG-2细胞中XAF1基因表达的影响，并构建XAF1 基因反义干扰表达载体，该载体将为进一步深入研究XAF1基因在姜黄素抑制HepG-2细胞增殖中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1。1  实验材料

人肝癌HepG-2细胞由生命与环境科学学院提供。

DMEM 高糖培养基（Boster），新生牛血清（四季青），胰蛋白酶（EDTA，酚红，南京凯基），DMSO（Bio Basic），PBS，封口膜（Parafilm），Trizol（Beyotime），DEPC（BBI），AMV 第一链cDNA 合成试剂盒（Sangon），琼脂糖（BIOWEST，G-10），50×TAE（Sangon），溴化乙锭（EB，Sangon）， pGreen-PourTM shRNA（Clontech），BamH1和Ecro1（TaKaRa），大肠杆菌DH 5α感受态细胞（TransGen Biotech），T4 DNA连接酶（Fermentas），GeneTran 转染试剂（Biomiga），EndoFree 质粒DNA 大量提取试剂盒（Biomiga），AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒、、姜黄素（BioBasic）。

移液枪、数显恒温水浴锅（DK-8D，上海精宏），THZ-C恒温振荡器（江苏太仓），CO2 培养箱（HF151，Heal Force），单人双面垂直净化工作台（VS-840-2，上海博讯），倒置显微镜（TS100，Nikon），全自动正置荧光DIC 显微镜及成像系统（90i，Nikon），分光光度计（Eppendorf，Biophotometer plus），水平电泳仪（Amersham Biosciences，EPS 301），凝胶成像系统（Tanon），电子天平（METTLER TOLEDO，PL203），常规PCR 仪（K960）。文献综述

1。2  实验方法 

1。2。1 细胞培养

细胞复苏：

将水浴锅预热至37℃，超净工作台紫外灭菌30min备用。从-80℃冰箱中取出装有HepG-2细胞的冻存管，迅速转移至37℃水浴中解冻，解冻过程中需不断晃动冻存管。待细胞悬液完全融化后，用75%的酒精对冻存管进行消毒，在超净工作台中打开冻存管上的封口膜，打开管盖，用移液枪将细胞悬液转移至含有3ml新鲜DMEM培养液（含10%小牛血清、1%青链霉素）的培养瓶中，将瓶盖适度拧紧，并将培养瓶置于37℃，5%CO2及饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。

传代培养：

用DMEM培养液（含10%小牛血清、1%青链霉素）贴壁培养人肝癌HepG-2细胞，当贴壁细胞密度达到90%以上时，即可进行传代。细胞培养和传代操作均在超净工作台中完成。细胞进行传代时，先将培养瓶中的培养液倒尽，用PBS洗两遍，再加入1ml、0。25%的胰蛋白酶溶液进行消化，密封后将培养瓶置于37摄氏度培养箱中孵化，直至在显微镜下可观察到所有细胞变成球形。将胰蛋白酶溶液倒尽，旋紧瓶盖后轻轻拍打培养瓶，使贴壁细胞脱落，然后加入5ml新鲜DMEM培养液，用枪头吹打至细胞悬浮液混合均匀。最后，按1:3的比例对HepG-2细胞进行传代培养。

细胞冻存：

当贴壁细胞密度达到90%时，消化细胞，加入10%小牛血清（培养液中已含10%的小牛血清），10%的DMSO溶液，混匀后用移液枪吸取1mL混合液移入灭菌后的冻存管中，拧紧管盖，用封口膜封好。将冻存管置于梯度冻存盒中，放入-80℃冰箱中保存。

1。2。2 细胞处理

将HepG-2细胞接种于含DMEM培养液的6孔板中，用20μM浓度的姜黄素以不同的时间梯度（0、3h、6h、12h、24h）处理HepG-2细胞。将细胞置于37℃，5%CO2及饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

1。2。3 Trizol法提总RNA

离心机预冷准备。将6孔板中的培养液吸干净，每孔中加入1mLTrizol试剂。用枪头划板1min使细胞充分裂解后移入PCR管中，用涡旋仪混合均匀。加入200μL氯仿，用涡旋仪剧烈混匀，置于冰上10min。随后4℃、12000g离心15min。离心后吸取上清液（不要将白色物质吸入）放入另一PCR管中，置于冰上，每管中加入500μL异丙醇（4℃预冷），轻轻混匀，放在冰上10min，再4℃、12000g离心10min。弃上层液，加入1mL70%乙醇（4℃预冷）混匀，4℃、7500g离心10min。弃上清液，将离心管倒置于干净的吸水纸上沥干，室温烘干5min左右，加入20μLDEPC水溶解。