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1。3方法

1。3。1  PDA培养基的制备

称取所需重量的马铃薯，削去外皮，切成片状，煮沸30 min,用四层纱布过滤，按重量比例加入琼脂和蔗糖，加热融化后补足水至刻度（配制液体培养基不加琼脂）。配好的培养基121 ℃灭菌20 min备用。

1。3。2桦褐孔菌菌核中微生物的分离纯化

1。打开超净台的紫外灯对超净台进行消毒，并盖上布帘，大约15 min后掀开布帘，关闭紫外灯，打开玻璃并开启适宜档位的风速，吹10 min左右后关闭；

2。在超净台内用浓度为75%酒精对双手进行消毒，然后用相同浓度的酒精将菌核外表擦拭消毒，用消过毒的刀片切取小块的菌核组织块，将切下的组织块接到PDA试管斜面上并放置恒温培养箱设置到28 ℃进行培养；文献综述

3。定时观察生长状况，将组织边缘长出的真菌转移到新得培养基上进行纯化，纯化后的菌种再转接到新的PDA试管斜面上，同样条件培养几天后转至4 ℃冰箱保存备用。

1。3。3桦褐孔菌菌核内微生物的形态学观察

1。取纯化后的8株菌，分别接种到24个PDA平板中，每株接三个平板并标序；

2。将接过菌的培养基放入恒温培养箱28 ℃下培养；

3。待其生长3-5天至一定程度后,选择同一时间点观察记录菌落大小、颜色、菌丝生长情况等并拍照；

4。挑取菌落上的产孢结构置于载玻片上，制成新鲜标本，在显微镜下观察菌丝、孢子体的形态，并用显微成像系统记录图片。

1。3。4内生真菌基因组DNA的提取

1。 DNA的提取：

（1）在超净台中，用事先已经过高温灭菌并放置烘箱中干燥过的竹签从平板上刮取8种菌株的菌丝于8支离心管中并标序，注意尽量刮取菌丝生长的最边缘部分，每株约0。05 g；

（2）用试剂盒提取DNA:

A。将离心管中的菌丝分别加入到8个研钵中，加入液氮充分研磨至细密的粉状，进行此过程的同时准备8支新的离心管重新标序，用适宜量程的移液枪在新的离心管中加入700 μL缓冲液GP1并盖紧管盖，将水浴锅温度调至65 ℃，待水浴锅温度上升至65 ℃并保持稳定时，将离心管放置水浴锅中水浴20 min,水浴过程中摇晃离心管数次使样品充分混合；

B。水浴结束后，取出离心管迅速加入巯基乙醇使其终浓度为0。1%，然后将研钵中的粉末加入到对应的离心管中，盖紧管盖使劲摇晃使菌粉和液体充分混匀，然后水浴20 min;

C。加入700 μL氯仿，同样用力摇晃离心管，在离心机12000 r/ min下离心5 min;来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

D。将离心后管中的上层水相用移液枪小心地转入到一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，摇晃至充分混匀；

E。将混匀的样品迅速转入到吸附柱CB3中，12000 r/min下离心30 s,倒掉离心后的废液；

F。向吸附柱中加入500 μL缓冲液GD（使用前已加入无水乙醇），12000 r/ min下离心30 s,倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

G。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前已加入无水乙醇），12000 r/ min下离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

H。重复步骤G；

I。将吸附柱放回收集管中，12000 r/ min下离心2 min,倒掉废液。由于漂洗液中残留的乙醇会影响后续的酶反应（酶切、PCR等），所以需要将吸附柱置于室温直至彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。