2 材料与方法

2。1 菌种及主要试剂

实验所用病原菌P。digitatum分离自自然发病的柑橘。BA购自美国Sigma公司，PCR所需试剂购自日本TAKARA公司，其他主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，柑橘购自当地市场。

2。2 病原菌的分离及rDNA-ITS法鉴定

利用75%的无水乙醇对发病柑橘进行消毒，风干后在病斑边缘去除果皮，切取面积为0。1 cm2左右的果肉置于PDA（potato dextrose agar）培养基上，28 ℃培养24 h后，在菌落边缘分离菌种，转移至新的PDA培养基上，25 ℃培养4天，观察、拍照后，用含有0。05%（v/v）Tween-20的无菌水收集孢子，经4层无菌纱布过滤后使用。将孢子悬浮液加入PDB（Potato dextrose broth）培养基中，调节终浓度为1。0×106 spores·mL-1，摇床振荡（28℃, 200 rpm）培养12 h后收集菌丝。液氮研磨后使用DNeasy Plant Mini Kit提取病原菌基因组。利用真菌ITS通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'- GGAAGT来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-GTCGTAACAAGG-3'）进行PCR扩增（Gardes and Bruns, 1993）。PCR反应体系为ddH2O 11。9 µL、5×Buffer 4 µL、dNTP（2。5 mmol·L-1）1µL、ITS4及ITS5引物（10 µmol·L-1）各1 µL、Primestar HS DNA polymerase（2。5 U·µL-1）0。1 µL、模板DNA 1µL。PCR反应参数：94 ℃变性5 min；94℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖（浓度为1%）凝胶电泳（120 V恒电压，20 min），利用Gel Extraction Kit回收目的片段，送至上海英俊生物技术有限公司测序，最终确定菌种类别。文献综述

2。3 BA最低抑菌浓度的确定及对P。digitatum芽管伸长的影响

将分离的病原菌P。digitatum接种在PDA培养基上，28℃培养箱中培养1周，按以上中所述方法收集孢子。将P。digitatum孢子悬浮液等量加入到含有100 ml PDB培养基的250 ml三角瓶中，调节孢子终浓度为1。0×106 spores·mL-1，分别加入不同浓度的BA（0、0。02、0。04、0。08、0。10、0。12g/100ml）。28 ℃、200 rpm振荡培养，分别在5、7、9、11h后用光学显微镜统计孢子萌发率（当芽管长度大于等于孢子直径的1/2时视为孢子萌发），确定BA的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC，本文指相同培养时间空白组孢子萌发率≥85%时，处理组孢子萌发率≤10%时的浓度），并分别在培养11、13、15、17 h后利用显微镜镜头标尺测量最低抑菌浓度处理组芽管的长度[15]。每种处理随机统计100个孢子的萌发率及芽管长度，三次重复，整个实验重复两次。

2。4 BA对P。digitatum菌落扩展的影响 

将100μL浓度为1。0×106spores/mL的P。digitatum孢子悬浮液均匀涂布在PDA培养基上，培养24 h后，用打孔器获取直径为0。5 cm的菌饼，放置在含15 mL PDA培养基的培养皿（直径为9 cm）中央，培养基中含有得出的最适抑菌浓度的BA（0。1 g/100mL），空白PDA作为对照。28 ℃培养，分别在培养1、2、3、4、5、6天后测量菌落直径。

2。5 BA对P。digitatum菌丝生物量积累及总糖吸收率的影响

将培养2周的P。digitatum孢子，孢子悬浮液等量加入到含有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，调节孢子终浓度为1。0×106 spores·mL-1。培养基中含有BA（0。1g/100mL），空白PDB作为对照。28 ℃、200 rpm振荡培养24 h，菌液12000 rpm离心15 min，分别收集上清液和沉淀。收集的沉淀在65 ℃烘箱中烘干至恒重（约2h）后称重，上清液则利用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）对培养基总糖含量进行定量分析，实验大致过程如下：精确称取100 mg葡萄糖，随后溶于蒸馏水并定容至100 mL，再用标准葡萄糖溶液配制成含0 μg·mL-1至100 μg·mL-1梯度的标准葡萄糖溶液。吸取1 mL上述标准葡萄糖溶液，加入2 mL DNS试剂混匀后，再在沸水浴中煮沸5 min，经冷却后加入9 mL蒸馏水，然后利用分光光度计（UV-160，Shimadzu）在540 nm波长下测量吸光度。重复3次，利用所得平均值获得标准曲线。取5 mL待测样品，加入4 mL 6 mol·L-1 HCl溶液，沸水浴中水解0。5 h，冷却后定容至50 mL，然后用6 mol·L-1 NaOH溶液中和至pH 7。0后用滤纸过滤，滤液用蒸馏水定容至100 mL。取出1 mL滤液，测定A540光吸收值，通过标准曲线的对比，获得样品中可溶性糖浓度C。总糖吸收率=（C培养前-C培养后）/C培养前×100%，每种处理重复3次。