本研究以抗盐型品种‘阳江’狗牙根为材料，以前期通过cDNA-AFLP技术获得的部分CdCLCc序列（包括3’端）为基础，克隆其全长序列，并进行盐胁迫下荧光定量表达分析和生物信息学分析。本研究不仅可以进一步理解狗牙根抗盐（氯）机理，为抗盐性持续改良提供实验依据，同时也有利于抗盐植物中的抗盐基因挖掘，为其他抗盐性差的植物提供优质的关键抗盐基因。

2  材料和方法

2。1  植物材料

以前期实验筛选出的抗盐型品种‘阳江’狗牙根和敏盐型品种‘南京’为材料[13]，其中‘阳江’狗牙根叶色深绿，匍匐性强，密度高，成坪快，草层厚，耐践踏性强，抗盐很好，能够在重度盐碱地形成较高质量的草坪。文献综述

2。2  植物材料RNA提取

采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（原平皓（天津）生物技术有限公司）提取材料的RNA，具体步骤如下：

1）取干净的‘阳江’狗牙根叶片，在液氮环境下将植物材料迅速研磨成粉末，加入500微升SL（使用前需加入β-巯基乙醇），立即震荡混匀，12000rpm下离心2min。

2）将上清液转移至过滤柱CS（过滤柱CS置于收集管中），12000rpm离心2min，小心收集上清液至新的RNase-Free的离心管中，吸头要避免接触管底的细胞碎片沉淀。

3）缓慢加入200 µL的无水乙醇，混匀，将得到溶液一起转入吸附柱CR3中，12000 rpm离心15 s，弃去收集管中废液，将吸附柱CR3重新放入收集管中。

4)向吸附柱CR3中加入350 µL的去蛋白液RW1，12000 rpm离心15 s，弃去收集管中上清液，将吸附柱CR3重新放回收集管中。

5)向吸附柱CR3中加入80 µL的DNase I 工作液，室温15min。

6)向吸附柱CR3中加入350 µL的去蛋白液RW1，12000 rpm离心15 s，弃去收集管中上清液，将吸附柱CR3重新放回收集管中。

7)向吸附柱CR3中加入500 µL的漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12000 rpm离心15 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3重新放回收集管中。

8)再将此步骤重复一次后，12000 rpm离心2 min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向中间部位悬空滴加40 µL RNase-Free ddH2O放室温2 min后，12000 rpm离心1 min，得到RNA溶液。

2。3  RNA质量检测

称取0。25 g琼脂糖，加入25 ml缓冲液，微波炉加热至融化，等微热后加入2。5 µL核酸染料EB，倒入模具中制成电泳需要的胶。吸取RNA溶液2 µL加入1 µL loading buffer，混匀后用移液枪点样到胶孔中，其中第一孔点Marker，然后120V恒压跑胶15-20 min，取出胶块放入凝胶成像仪中观看拍照。

2。4  mRNA反转录合成cDNA

I cDNA第一链合成（使用Takara cDNA第一链合成试剂盒）

GSP1作为引物（取代OligoT），引物浓度为50μM，反转录温度采用50℃（试剂盒为42℃）

II反转录产物纯化（使用Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit）

1)室温, 结合溶液binding solution来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

2)100μl ddH2O， 65℃预热

3)加入120μl binding solution （6M NaI）至第一链反应液中

4)将cDNA/NaI 加入S。N。A。P柱中，13000g离心20s

5)将滤液转至小离心管中（保存滤液直至cDNA都确定回收），将纯化柱重新置于离心管中

6)加入0。4ml 预冷（4℃）1Xwash buffer，13000g离心20s，弃滤液，重复3次

7)加入0。4ml 预冷（4℃）70%酒精，13000g离心20s，弃滤液，重复2次

8)13000g离心1min，将纯化柱放入新离心管

9)加50ul预热（65℃）ddH2O，13000g离心20s，洗脱