1。3  海藻糖合成酶的提取工艺 

1。3。1  传统提取工艺

对于海藻糖合成酶的利用，传统的方法通常先将细胞破碎，经浓缩，过滤，超滤，再浓缩等步骤逐级分离纯化后才可使用，酶活损失较大，用地大，时间久，机械损耗大，最后的产率却不高。常见细胞渗透处理方法有物理法和化学法。物理法是指利用机械的方法强行破除细胞的细胞壁和细胞膜，从而使细胞内的物质流出细胞。化学法是利用一些化学试剂通过和细胞膜上的脂质发生反应，使细胞的细胞膜结构发生改变，从而改变了通透性[15]。

1。3。2  细胞的透性化处理

细胞透性化技术主要包括化学法、物理法和生物法。在具体的研究和应用中，应根据具体情况和应用选择合适的方法。

(1)化学法:化学法是利用一些化学试剂通过和细胞膜上的脂质发生反应，使细胞的细胞膜结构发生改变，从而改变了通透性。由于不同菌种他们的细胞膜中的成分各不相同，所以通透性试剂对于不同菌种的处理效果不同，但该方法较容易放大和应用于工业生产[16]。化学法主要包括有机溶剂法、去垢剂法以及螯合荆法等。透性化处理操作时，通常选取一种或者多种用于改变细胞通透性的化学试剂，通过对加入通透性试剂的浓度，培养的时间，对比不同的温度，三种因素综合考虑，加以结合和比较，以选用最佳方法[17]。

(2)物理法:物理法是指利用机械的方法强行破除细胞的细胞壁和细胞膜，从而使细胞内的物质流出细胞。虽然其费时费力，处理设备昂贵，易损坏。但其具有大规模生产的能力，所以现在许多分子下游分离纯化行业的主要处理方法还是立足于物理法。物理法主要包括渗透压休克法、低温冷冻、脱水干燥、超声法等。渗透压休克法在提高细胞膜通透性的同时可避免有机溶剂、去垢剂等其他外源性化学物质对细胞造成的损伤[18]。

(3)生物法:生物法是指利用微生物的次生代谢产物，例如抗生素、酶、多糖，对细胞进行破坏细胞膜使其通透性改变的处理。目前，生物法主要用于研究微观下分子与分子具体的反应作用机制方面。

常用的化学透性化试剂有甲苯、氯仿、乙醇、吐温、溶菌酶等试剂。但由于甲苯、氯仿等化学试剂对人体有毒害作用，存在食品安全隐患；处理细胞过程中易造成环境污染，同时也增加了海藻糖后续分离的难度，大大限制了化学通透性试剂在食品领域中的应用。物理方法费时费力，处理设备昂贵，易损坏，易损失产量。生物法的处理和操作相比较于物理法和化学法来说很柔和。采用抗生素、酶、多糖等生物通透剂处理细胞时，只破坏细胞膜结构，而对胞内酶系几乎没有影响，胞内酶系依旧保持完整，使小分子底物能够自由进出细胞，而不会造成产量的损失。因此，开发简便高效的生物法透性化处理技术将成为今后的研究方向之一[19]。论文网

1。4  硫酸粘杆菌素对细胞的透性化处理

硫酸粘杆菌素是一种具有抗菌活性的透性化活性剂，最早在杆属多粘芽肥杆菌变种粘菌素（Bacillus Polymyxa var。 colistinus）的培养基中被发现，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，作为饲料添加剂在饲料工业中已被广泛采用。研究表明，其抗菌机制主要是与细菌胞浆膜中脂蛋白的磷酸酯盐相互作用，使胞浆膜的膜结构发生改变而导致通透性增加，进而使胞内成分特别是嘌呤嘧啶从细胞原浆中逃逸，以导致细菌死亡。

1。5  海藻糖的测定方法

HPLC是目前理想的快速、准确测定海藻糖的方法。本次实验采用HPLC法，测定海藻糖合成酶酶活和酶的转化率。具有方便直观，准确的优势。从海藻糖发酵液中取15 ml的通透性处理的细胞悬浮液菌液加入50 ml的30%（W/V）麦芽糖底物中，200 rpm，25℃下摇床培养30 min。30 min后，放入离心机中，配平，5000 rpm离心10 min。离心完成之后，把离心管用浮板固定放入电磁炉锅中煮沸灭活10 min。完成后，用此离心管的混合液体做HPLC。本次HPLC采用的流动相比例是100%乙腈、72%乙腈（乙腈和水的比例），能够将混合物完全分离。在此之前我们还进行了下面的工作，做了海藻糖、麦芽糖、葡萄糖的标准曲线，求出了这三条曲线的方程。待测液体经HPLC处理得到4个峰，第一个峰是水峰，第二个峰为葡萄糖的峰，第三个峰是麦芽糖的峰，第四个峰是海藻糖的峰。通过海藻糖的峰面积和麦芽糖的峰面积代入做好的标准曲线中，可以求出海藻糖酶的酶活和转化率。