经研究发现，C。albicans细胞内ROS的累积导致线粒体膜电位的变化，在电子传递的条件下，线粒体可在内膜的两侧，形成跨膜的线粒体膜电位MMP[16]。细胞内ROS的累积，导致线粒体基质中的质子泵出，从而导致线粒体电势异常升高（线粒体膜电位超极化），从而导致线粒体内的渗透压升高，外膜被涨破，并外泄细胞内容物使细胞死亡[16]。Rh123是一种荧光染料并具有通透性，可以检测C。albicans内Rh123的荧光强度，来观察线粒体内膜电位的变化，可用流式细胞仪检测荧光强度。Cyt C是线粒体呼吸链的一部分，由于Cyt C具有亚铁血红素，可以进行传递电子。当Cyt C缺乏时，电子间的传递链被阻断，造成ATP减少以及ROS的过度生成[17]，说明Cyt C的释放是C。albicans凋亡的关键。半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)主要存在细胞质中，能选择性地切割特定的蛋白质，从而造成C。albicans凋亡[18]。在C。albicans细胞中，存在Caspase的同源结构Metacaspase[19],用FITC-VAD-FMK可以在原位检测到Metacaspase的活性，Metacaspase活性可通过流式细胞仪检测分析。此外，橙花醇诱导C。albicans细胞凋亡形态变化，可用TUNEL试剂盒来检测，细胞核DNA的断裂，是细胞在凋亡过程中会出现的形态变化。当细胞发生凋亡时，伴随着DNA内切酶的激活，基因组DNA(核小体中)会被切断。当其断裂时，用TdT催化裸露的3’-OH，并加上标记的dUTP，在荧光显微镜下，观察细胞核DNA的断裂情况。

本课题是以橙花醇为研究对象，通过检测活性氧、线粒体膜电位变化、Metacaspase的活性检测等实验，对橙花醇诱导C。albicans细胞凋亡的作用机制展开深入研究，对于其作为抗真菌疾病新药的开发前景有着非常重要的意义。

1 材料与方法

1。1供试材料

1。1。1原料

橙花醇：购买于上海晶纯生化科技股份有限公司

白色念珠菌：由江苏师范大学生命科学学院微生物学实验室提供

1。1。2主要试剂

本实验使用的试剂见表1

表1  供试试剂名称目录

Table 1  Name of Reagent Tested

试剂名称 化学式 生产厂家或地址

吐温-80 C64H124O26 上海广诺

磷酸氢二钠 Na2HPO4·12H2O 上海国药

EDTA C10H16N2O8 上海广诺

无水葡萄糖 C6H12O6 上海生工

琼脂粉 C12H18O6 上海国药

无水乙醇 C2H6O 上海广诺

磷酸二氢钠 NaH2PO4·2H2O 上海国药

Tris C4H11NO3 上海生工

盐酸 HCl 上海广诺

氯化钠 NaCl 上海国药

Triton-X-100 C34H62O11 —

甲醇 CH4O 上海生工

蛋白胨 — 上海国药

过氧化氢