蛋白质样品制备是双向凝胶电泳和基于质谱的蛋白质组学研究成功的关键。其一般过程是对细胞或组织等样品进行溶解、破碎，断开蛋白质之间的二硫键、疏水键、氢键和离子键，尽最大可能的从复杂蛋白质混合物中分离蛋白质[11]。

在样品制备过程中溶解并提取蛋白质需要用到裂解液，其基本组成成分为去污剂、还原剂、表面活性剂等物质[12]，可以将所有蛋白质转化为单一构象，破坏其蛋白质的二硫键和疏水键，使蛋白质充分被溶解。

目前，蛋白质组学研究的常用样品制备方法是含高浓度尿素的裂解液体系，通过破坏蛋白质的二级结构的氢键和三级结构的离子键、疏水键，来使疏水蛋白溶解[13]。为了达到蛋白质的完全去折叠效果，还需要二硫苏糖醇（DTT）来还原蛋白质的二硫键。文献综述

在破碎细胞的时候尤其要注意其中存在的酶可以降解蛋白质，蛋白的产生和降解在生命体体内是一个稳定地平衡状态，但是用于体外研究中，蛋白质的合成终止，蛋白质的降解便大大增加。十二烷基硫酸钠（SDS）或者三氯乙酸（TCA）沉淀可以有效的降低蛋白酶活性，添加蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟（PMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶，不加蛋白酶抑制剂会造成大分子量的蛋白质丢失[14]，目前常用的是cocktail混合型蛋白酶抑制剂，效果更好。

1。5 蛋白质定量

1976年由Marion M。 Bradford[15]建立的考马斯亮蓝法（Bradford法），原理是蛋白质在酸性环境下与考马斯亮蓝G-250染料相结合，染料会从棕红色变为蓝色。其作用机理是：染料首先将其自由电子提供给蛋白质上的可离子化基团，破坏了蛋白质的天然构型，从而暴露其疏水性基团，通过范德华力和静电的相互作用与蛋白质的羧基形成非共价复合物。蛋白质的结合稳定了考马斯亮蓝G-250染料的蓝色形式，在595nm处有最大吸光度，溶液中存在蓝色的量与蛋白质的量形成正比，即染料的吸光值与蛋白质的浓度形成正比，可以用分光光度计去测定蛋白质的浓度。测定蛋白质浓度范围为0-0。5mg/mL，所以当提取的蛋白溶液浓度大于该范围时，需要提前稀释蛋白质样品。

1。6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）同时利用了分子大小和电荷差别两种属性，从而达到分离目的。粒子迁移率与电场的关系可近视地表现为以下公式[16]：

式中： M——粒子的迁移率（cm2·s-1·V-1）

——粒子的迁移速率（cm2·s-1）

E——电场强度（V·cm-1）

通过使用多相缓冲系统和浓缩胶可以实现SDS-PAGE电泳高分辨率的蛋白质分离。浓缩胶的一个重要作用就是对蛋白溶液进行浓缩，这一过程将最初的样品压缩成宽度狭窄且高浓度的起始区带，使得所有的蛋白分子在开始电泳分离时都处于同一起跑线，并通过突然增高pH和减小分离胶的孔径可以达到分离蛋白质的目的。

2。本课题的研究目的和意义

2。1 本课题的研究目的

本课题的研究目的是建立脂肪组织总蛋白的提取方法，通过设计不同方法来提取脂肪组织总蛋白，分析不同提取方法对提取蛋白质的浓度、提取率以及蛋白电泳图谱的影响，优化脂肪组织总蛋白的提取方法，并为公司提供最有效的提取流程，提高工作效率。为深入开展脂肪组织蛋白质组学的研究提供基础，有利于了解脂肪代谢相关疾病的发生发展机制，开发相应的治疗方案。

2。2 本课题的研究意义来:自[优.尔]论,文-网www.youerw.com +QQ752018766-