3．2．2．4  构建基因表达载体与菌落PCR

该步骤所用的试剂盒为pEASY-Blunt Cloning Kit（北京全式金生物技术有限公司），克隆载体为pEASY®-Blunt Cloning Vector(10 ng/μl)，用于高保真PCR产物平末端的连接。所用大肠杆菌为（E。coli）Trans1-T1感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）。

构建基因表达载体然后进行菌落PCR，将菌液PCR产物跑1%琼脂糖凝胶电泳。选取含有目的条带的菌液送到金唯智公司基因测序。

3．2．2．5  实时荧光定量PCR

利用实时荧光定量PCR方法对各个基因在菊芋块茎全生育期不同器官的表达水平进行定量分析，该步骤所需引物与上述PCR过程中所用的引物相同，Ht Actin为内参基因，在Step One Plus Real-time PCR system实时定量 PCR 仪上，使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa公司）进行分析，机械重复3次。

PCR反应体系为20μL：c DNA（50 ng · μL-1）2 μL，上下游引物（10 μmol · L-1）各0。4 μL，SYBR ® Premix EX TaqTM（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0。4 μL，dd H2O至20 μL。PCR 反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性 30 s，60℃退火延伸34 s，30个循环，各基因的扩增效率偏差小于10%，得出的试验结果采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量。

3．3  数据统计及分析

    基因的相对定量表达数据用SPSS 19。0（SPSS Corp, Chicago, IL, USA）进行统计学分析，显著性来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-差异用单因素方差分析中的Dunnett’s t-检验来评价处理。不同时间采的样，不同器官的基因表达水平、糖含量变化用SigmaPlot 10。0（Systat Software, Inc。Germany）进行统计绘图。

4  结果与分析 

4．1  菊芋萌发过程中的糖分变化。

本实验设计的菊芋处理温度为20℃，菊芋在一周内会发芽，分别测其在发芽期间块茎与芽的的低聚合度糖葡萄糖、果糖、蔗糖与高聚合度的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的含量变化，分别分析块茎与芽中的糖分变化，可以得出发芽期间菊芋糖分总量是减少的，而且高聚合度的糖和低聚合度的糖变化是不同的。