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当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为: I/ I0
根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律: A=abc
式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/mL)， a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。
由上式可知，当固定溶液层厚度b和吸光系数a时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长，然后以此波长的光为入射光，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A-c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。
（1）朗伯—比耳定律
布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度成正比：
A∝b
1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有成正比的关系：
A∝c
二者的结合称为朗伯—比耳定律。即当一束平行的单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比【5】。
(2） 朗伯—比耳定律定义
朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据，应用于各种光度法的吸收测量。它不仅适用于可见光，也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀非散射的液体，也适用于固体和气体【5】。
朗伯—比耳定律的数学表达式为：A=lg(1/T)=εbc
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；
c：溶液的摩尔浓度，单位mol/L；
ε：摩尔吸光系数，单位L/mol/cm 。
（3） 摩尔吸光系数ε的讨论
摩尔吸光系数是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数，它不随浓度c和光程长度b的改变而改变。同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关，因此可作为定性鉴定的参数。
εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。
一般，ε>105 为超高灵敏；ε=(6～10）×104 为高灵敏；ε< 2×104 为不灵敏。
在λmax 时，A=0.001 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量称为桑德尔灵敏度指数，S （μg/cm 2 ）。
吸光度A与透光度T的关系为 A ＝ －lg T，当用分光光度计测定时应尽量使溶液透光度值在T %=20～65%，即最佳吸光度的读数范围为： A =0.70～ 0.20。当浓度相对误差最小时的透光度 Tmin为：Tmin＝36.8%,这时的吸光度 A ＝0.434。
1.2.2 分光光度计
依据分光光度法测量原理，把比较法应用到仪器之中——浓度直读功能。用标准溶液将仪器调整好，再测定样品时，将直接显示样品浓度值。