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1.2 重组E.coli发酵工艺概述
E.coli因其培养条件简易、遗传背景清楚、生长速度快、发酵周期短、分子操作性强等诸多优点，在基因工程领域已经成为使用最广泛的宿主菌[4]。基因工程菌株可以使某些原本在野生菌株中不能或微量表达的蛋白和不能合成的有机化学品实现了大量表达合成。而实现产品的工业化生产与成熟的重组菌发酵工艺是紧密相关，因此实现基因工程技术和工程菌的发酵工艺的有机结合，无疑会为重组产品实现大规模生产奠定基础。
1.3在E.coli中MEP途径介导的生产异戊烯醇的研究
MEP途径是绝大多数真细菌中用于合成类异戊二烯的前体：异戊酰焦磷酸（IPP）或二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）的唯一途径（图1）。
首次利用工程菌生产异戊烯醇是在2007[5]，随着枯草芽孢杆菌基因组检测技术的提高，我们发现两个编码蛋白酶的基因yhfR和nudF在异戊烯二磷酸前体、异戊烯焦磷酸（IPP)、二甲基丙烯焦磷酸酯的合成中直接相关，并将它们转变成异戊烯醇。2012年，人们又发现编码蛋白酶的基因nudB可以将异戊烯焦磷酸前体转变成异戊烯醇[6]。这些基因的过量表达以及在E.coli中引入异源甲羟戊酸依赖性途径（MVA）成功提高了异戊烯醇的产量[7]。除了MVA途径，E.coli天然的MEP途径也有用来合成异戊烯醇的潜力。事实上，对其他形式的类异戊二烯产物，包括紫杉醇的生物合成的尝试已经取得成功[8-9]。到目前为止，报道的通过MVA途径比通过MEP途径生产异戊烯醇的产量更高。另一方面，利用MEP途径也有其优点：根据先前对化学计量和氧化还原平衡的研究[10]，MEP比MVA更趋向平衡，理论上将糖或甘油转化成异戊二烯的效率更高。此外，由于MEP途径固有存在，它需要引入的异源基因较少。
因此，我们要做的就是通过优化其固有的MEP途径来增加异戊烯醇的产量。我们首先合成了两个密码子优化基因：nudF和yhjR都来自枯草芽孢杆菌，使得它们在宿主E.coli W3110中表达，赋予其宿主生产异戊烯醇产物，包括苯酚和异戊二烯。
1.4纤文素介绍
纤文素是植物纤文原料的主要成分,是由β-D-葡萄糖通过1,4-糖苷键连接而成的线性葡聚糖高分子化合物。其聚合度会根据D-葡萄糖基含量的不同而变化，不同的植物资源的纤文素聚合度也不尽相同[11]。微纤丝主要通过分子内氧键以及分子间范德华力形成微纤文从而聚合成纤文素。然而,纤文素存在不同的晶型结构,纤文素I是纤文素Iα和Iβ的混合物。由于纤文素存在交替的无定型结构和结晶结构,导致其很难被利用。因此,为了提高纤文素的利用率,研究人员尝试了多种方法,包括物理方法(如蒸汽爆破、超声处理、球磨),化学方法(离子液体溶解、酸水解)和生物方法(褐腐菌降解、白腐菌)及综合物理化学的方法来破坏纤文素的结晶结构[12]。
1.5离子液体应用于生物质组分溶解及分离
离子液体的历史要追溯至1914年Walden发现销基乙胺,但当时并未受到关注。1992年Wilkes等人合成了在空气中和水中稳定的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体([Emim][BF4]),离子液体才广泛地被科研人员认识到并逐渐开始应用于电化学等研究领域。近年来,作为绿色溶剂的离子液体具有很多其他溶剂无法达到的优点被广泛应用于生物质利用、酶解、催化、材料制备等多个领域。
1.5.1离子液体的定义、优势、组成及合成
离子液体(Ionic liquids, ILs),是一种在低温下(<100 T)呈液态的盐,一般由有机阳离子和阴离子构成。具有不易燃、熔点低、可设计、稳定性好、难氧化、不挥发等优势。离子液体的阳离子主要有1,3-二烷基取代的咪唑离子、N-烷基取代的吡啶离子、季铵盐离子等,阴离子主要有Cl-、Br-、I-、NO3-、PF6-、BF4-等[13]。所以可根据阴阳离子的特性来设计所需要的离子液体,可设计性也是离子液体广泛应用的原因之一。