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6 致 谢 24
7 参考文献 25
1 研究背景
1.1 腈水解酶的介绍
腈化合物(R-CN)是一类很常用的化合物,它的种类很多,各种自然和人工合成的腈类化合物总数超过了 20000多种,其中大部分来自于人工合成[1]。腈类化合物也可以通过植物自身的合成产生,通常是作为激素的前体物质(苯乙腈),或者植物体内的存储化合物(腈脂)等等[2]。腈类化合物在工业上的重要应用是其往往能够作为底物,然后通过化学方法合成一些所需的医药中间体或者其他有用的物质。然而,目前工业上的腈类水解所采用的化学方法受到很大局限,因为其需要非常苛刻的条件,比如强酸、强碱或者高压等,而且产生的不期望的副产物具有一定的毒性,容易对环境造成危害。但是,通过生物催化腈类物质来产生对应的羧酸和酷胺类物质,此过程能够在很温和的条件下发生,而且产物具有较高的立体选择性[3]。通过大家都广泛熟悉的例子,比如丙烯酰胺的生产,生物法转化腈类化合物的潜力已经得到了证明[4] 。
腈类化合物的生物催化目前来说,主要是通过两种途径。一种是腈类化合物在腈水解酵的作用下通过一个直接的生物转化,释放氨从而形成对应的羧酸[5]。在80年代初,另外一种首先是腈类化合物被水解成为酰胺类物质,随后再在酰胺酶的作用下生成对应的羧酸[6]。
图1.1 腈类化合物酶水解的途径
腈水解酶,作为第一个腈类转化酶,大概最早是在40年前发现，能够水解有机腈产生羧酸和氨。其因为能够转化3-吲哚乙腈生成3-n引哚乙酸而闻名。不像腈水合酶,腈水解酶在自然界各种存在的生物中发现,包括细菌、真菌、古细菌、植物和哺乳动物,其中细菌是腈水解酶的主要来源(Table 1)。
表1.1 一些具有腈水解酶活性的物种
Bacteria Plants Fungi
Acido vorax facilis 72W Barley Fusarium oxysporum
Acinetobacter sp. (Ak 226) Chinese cabbage Aspergillus niger
Bacillus sp. Strain OxB-1 Brassica rapa Penicillium multicolor
Commamonas testosteronl
Pseudomonas sp. (S1)
Rhodococcus NCIB 11215
Pseudomonas DSM 7155
Rhodococcus ATCC39484
Arthrobacter sp. J1
根据底物的特异性,腈水解酶普遍被分为三类:(1)芳香类腈水解酶,,主要是水解芳香腈。(2)脂肪类腈水解酶,是水解脂肪族的氰基。(3)芳基乙腈水解酶,主要能够水解芳基乙腈类物质。即使一些腈水解酶表现出了更宽的底物专一性,能够被同时的划分到不同类，现在依旧是如此分类。
根据氨基酸的同源性,腈水解酶属于蛋白超家族,也称作腈水解酶超家族。腈水解酶超家族中的酶都含有一个特定的空间结构。蛋白结构单元是由一个三明治结构组成。腈水解酶的结构已经通过X-ray衍射技术得到确定,其空间结构也通过与超家族内其他成员的同源性比较从而得到推理[7]。大部分腈水解酶在溶液中是以一种非激活的多聚体存在,这种多聚体能够与具有活性的低聚体结合[8]。这种聚合作用可以通过很多方式来激活,比如底物、高浓度的酶含量、或者是通过物化条件的改变,比如加热,高浓度的盐(KCL, MgSO4, NH4CL, (NH4)2SO4)以及加入有机试剂[9-12]。腈水解酶的酶活力主要与一个催化单元有关，其是由Glu-Lys-Cys组成的。反应开始首先由半胱氨酸的巯基亲核攻击腈的碳原子开始,从而产生一个共价键的链接。然后通过加入一个水分子从而形成一个四面体中间复合物。在这个过程中,以谷氨酸作为基础,而赖氨酸残基能够稳定住四面中间复合物。