2。3。2  实时荧光定量PCR检测脂肪组织自噬相关基因 (组织蛋白酶B(CTSB)、蛋白LAMP1、SQSTM1、MAPLC3B和TFEB )mRNA 

2。3。2。1 RNA提取

 实时荧光定量PCR实验原理:在PCR反应体系的过程中,添加过量的SYBR Green荧光标记分子,SYBR Green这个荧光标记分子会特异性地渗进DNA双链中,使荧光信号强度与PCR产物量成正比,这时待测产物会相应发出荧光,而没有渗进SYBR Green荧光标记的DNA双链由于没有相应标记不会发出任何相关荧光,对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析,计算出PCR产物量。在本实验中,SYBR Green染料一旦与双链DNA结合,荧光信号强度将大大增强,荧光的强度与DNA双链分子的数量成正比,因此,从而该荧光染料可用来实时监测PCR产物量的多少。

参照TRNzol-A+ 总RNA提取试剂操作规范,提取切取的附睾组织中全部RNA。

1)附睾脂肪组织处理:取新鲜的保存于-70℃的小鼠附睾脂肪组织,用刀片切取100 mg附睾组织放入离心管中,然后迅速在离心管中加入100ulTRNzol-A+,用匀浆仪多次快速将组织打碎,直至打成匀浆液体,为防止组织降解应迅速再加900ul TRNzol-A+。将取得的匀浆样品在静置10分钟,使得样本中的核酸蛋白复合物进行完全分离。

2)样品的分层:将混合均匀的样品中加入200ul氯仿,盖好管盖,振荡器旋涡混匀15秒,当液体混匀后室温静置5-10分钟等待分层,此步骤为提取RNA,舍去样本中的其他废弃组织。 

3)将分层后的样品缓慢放入离心机中,调整离心机为4℃ 12,000 rpm离心5分钟。取出后可以看出样品分成两层:下层为黄色的有机相和上层为无色的水相,两层物质被一层白色薄膜相分隔。所需提取的RNA主要存留在上层,把水相(约为450ul)分为三次,即每次150ul转移至新的1。5ml离心管中,每次吸取上层水相时候应注意不要触碰到分离两相间的白色薄膜,如吸取过程中不慎触碰到薄膜和下层有机相,此样本应废弃,重复之前的步骤提取新的样本。

  4)RNA的沉淀:在转移后得到的450ul的样品溶液中加入等体积异丙醇(即450ul),混匀后静置10分钟。

5)RNA的纯化:将样品放入离心机中(4℃ 12,000 rpm)离心10分钟,将纸巾按于离心管口小心倒置,弃去上清,并清理管口的废弃液。

6)RNA的洗涤:向离心管中加入0。5ml 75%乙醇(即加入35ml无水乙醇再加DEPC水至150ml进行配制)洗涤沉淀1次,此过程应缓慢进行,防止离心管底部的RNA样品倒出。

7)RNA的干燥:再次将样品放入离心机中(4℃ 12,000 rpm)离心10分钟,将纸巾按于离心管口小心倒置,弃去上清,并清理管口的废弃液,此过程应注意不要倒出在管底的胶状沉淀,所留下的少量液体进行快速离心,用枪头吸出多余废弃液,此过程在吸取时应注意不要触碰沉淀,以防止RNA被吸出,室温下将样品静置10分钟,晾干。

8)RNA的溶解:加入DEPC水100ul并将样品放入50℃恒温仪中,使沉淀充分溶解,放入-70℃冰箱中,待用于后续实验。

2。3。2。2 RNA质量检测

将冻存的RNA样品溶液解冻,先用移液枪吸取2ul DEPC水,滴于核酸蛋白测定仪,做RNA浓度测定的空白对照,后再用移液枪分别取2ul各样品RNA溶液分别做RNA测定,读取各样本的OD260/OD280比值,比值范围应为1。8到2。1,检测后将剩余的样品放入-70℃冰箱中保存待用。论文网

2。3。2。3 逆转录

参照快速反转录(FastQuant cDNA)第一链合成试剂盒说明,按照试剂盒的提供的方法进行操作。

1)实验试剂准备:解冻模板RNA,取出在-20℃冰箱中保存的5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、RNase-Free ddH2O 、10×Fast RT Buffer、RT Enzyme Mix ,在室温下解冻试剂,解冻完后将试剂置于冰上冷藏。

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