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2.3.1兔出血症病毒变异型VP60蛋白的表达 8
2.3.2 western blot鉴定蛋白与多克隆抗体的结合 8
2.3.3 结果 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 10
兔出血症病毒传统毒株和变异毒株VP60蛋白多克隆抗体的制备及其鉴定兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease virus, RHDV）引起的兔类高度致病性的疾病，具有急性、高度传染性、高度致死性的性质。能引起兔的全身器官水肿，尤其是实质性器官的水肿，还能引起淤血以及出血性的变化[1]。该病在1984年春于江苏无锡首次发现，在短时间内传播迅速，传染性极强，一时间严重影响了全国范围内的兔养殖业，至今在国内外养兔地区仍有存在和流行[2]，兔出血症一时间给全国乃至世界养兔业造成巨大的经济损失。
在法国，2010年第一次报道兔出血症病毒的变异型RHDV2。该变异毒株RHDV2与经典的G1-G6型在遗传特性上有很大的差异[3,4]。目前，该变异型毒株迅速在欧洲扩散，RHDV2感染家兔后死亡率高达70%，15至20日龄（未断奶家兔）以上家兔对该病毒均易感[3]，RHDV2既能够感染家兔又可以感染野兔。这个特点造成了它比经典的RHDV具有更大的危害性。目前已给欧洲养兔业造成了极大地损失。目前我国肉兔配套系100%依赖进口，进口国为法国等已经存在RHDV2流行的欧洲国家。目前尚无有效的检测方法判断该病毒是否传播入我国，不排除存在有隐性感染的可能[5]。因此，我国在检验检疫等方面应该加强对变异型兔出血症病毒的检测，开展在全国范围内的预防工作，以防止新型兔出血症在我国发生甚至大规模流行。
RHDV2为单股正链的DNA无囊膜病毒，呈正二十面体对称结构，直径32-44nm，RHDV2的基因全长7447bp[5]。RHDV2和RHDV一样同属于杯状病毒属，两者基因的同源性高达82.4%，同样引起兔病毒性出血症。经典RHDV疫苗免疫过的兔子也不能完全保护兔子免收RHDV2的侵袭，证明其不能对RHDV2产生良好的交叉保护，所以我们需要研发更加有效的疫苗来预防RHDV2引起的新型兔瘟[6]。
VP60蛋白为兔出血症病毒的结构蛋白，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关[7]。体外真核表达的VP60蛋白自我装配形成的病毒样颗粒形态与抗原性都和天然病毒粒子相似，不仅可以凝集人的红细胞，还可以在免疫后激发与天然病毒粒子相似的免疫保护反应。所以在研究兔出血症病毒的分子诊断和新型疫苗开发时，其 VP60蛋白是重要的研究对象[8.9]。经测序发现，RHDV2的VP60蛋白上与免疫保护相关的S1、S2片段高度变异。
本研究成功制备了RHDV和RHDV2的VP60蛋白多克隆抗体，测定其效价和特异性。并用Western Blot方法确定了RHDV的多克隆抗体不与RHDV2上S1和S2片段反应。为建立Elisa等免疫学方法以区别鉴定临床血清样品中感染的兔出血症毒株是经典RHDV还是RHDV2提供了良好的基础。并为预防新型兔出血症在我国流行和研究新型兔出血症VP60蛋白的功能和疫苗的研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
6-8周龄BALB/c小鼠18只，分成3组，6只一组，从扬州大学购买。
1.1.2免疫抗原
新型兔出血症VP60蛋白：根据GeneBank中RHDVN-11株基因组序号扩增VP60基因引物，对VP60基因进行扩增，之后构建和鉴定重组表达质粒，诱导表达新型突出血症VP60蛋白。
1.1.3 主要试剂
10%人O型红血球悬液(自行配置：将人 O型红血球用PBS洗涤三次后，用PBS配成1%的悬液)；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；蛋白电泳Marker（biorad 1610374 Marker）；羊抗鼠二抗（碧云天生物技术有限公司商品化抗体）；PBST洗液（自行配制：1L的PBS+1mL Tween 20）；转印液（自行配置：25mM Tris base，0.2 M glycine（甘氨酸），20% methanol（甲醇PH8.5））；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma F-5881、F-5506）；包被缓冲液（自行配制：1.59 g Na2CO3+2.94gNaHCO3+DDW定容至1L）。