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    传染性法氏囊病病毒(IBDV)结构蛋白VP3及其突变体表达纯化
    引言:传染性法氏囊病(Infectious bursal disease)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的,多发于3-6周龄雏鸡的一种急性传染病且同时具有高度接触性、易扩散的特征。该病的发病部位主要在雏鸡的中枢免疫器官―法氏囊,造成免疫抑制[1]。并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败[2]。发病后会出现如下主要临床症状:腹泻、颤抖、极度虚弱乃至死亡。法氏囊是禽类的中枢免疫器官,在禽类的免疫应答过程中起着重要的作用,当受到抗原刺激时,法氏囊会刺激B淋巴细胞使其产生特异性抗体,进而来完成机体的免疫应答过程,对机体起到免疫保护作用。而IBDV主要侵蚀鸡法氏囊,幼鸡感染后,会导致免疫抑制诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败。故本病对养禽业危害重大,是国际公认的鸡的三大疫病之一[3] 。
    传染性法氏囊病毒(IBDV)由五种蛋白质构成,即:VP1、VP2、VP3、VP4和VP5[3,4]。其中VP3和VP2共同形成病毒的核衣壳,二者约占到IBDV蛋白比例的90%以上,因此VP2和VP3是IBDV的主要结构蛋白。IBDV的抗原表位主要存在于VP2蛋白上,VP3蛋白上也存在一些线性表位,可诱导具有中和病毒活性的中和抗体产生。所以VP2蛋白和VP3蛋白对IBDV的抗原性起着决定性的作用。
    VP3羧基端含有较多的Proline和碱性氨基酸,与病毒蛋白VP1以及病毒基因组dsRNA相互作用并参与病毒的复制、组装、成熟,同时还有稳定病毒基因组dsRNA的作用[5]。为了更好的开展VP3相关实验,获得有活性的VP3蛋白,本研究旨在表达、纯化得到VP3蛋白,同时还对VP3截短体进行了表达纯化,由于IBDV在复制过程中,VP1-VP3组成IBDV的复制中心,已有文献报道,VP3的C末端16个氨基酸及负责和VP1相互结合[6]。本研究同时还表达纯化了,His-VP3(patch),His-VP3(KR),His-VP3△16。
    本次试验大体分为以下几个部分:
    1.初步分析His-VP3的表达方式及表达量;2.摸索VP3最佳表达条件:从表达时间、IPTG浓度梯度两个方面进行实验;3.大量表达并非变性纯化His-VP3;4.大量诱导并纯化VP3突变体蛋白,His-VP3(patch),His-VP3(KR), His-VP3△16。
    1  材料和方法
    1.1    材料   
    1.1.1  重组质粒及重组表达菌
    pET-28a VP3重组质粒、pET-28a VP3△16、BL21(DE3)pLySS、His-VP3(patch)、His-VP3(KR)、His-VP3△16。重组表达菌均保存于南京农业大免疫研究所。
    1.1.2 表达菌株
    BL21(DE3)pLySS表达菌株保存于南京农业大学免疫研究所。BL21(DE3)pLySS感受态细胞由75mM CaCl2低渗、低温处理,透化细胞壁制作而成,方便外源DNA进入工程菌。
    1.1.3  PCR菌液鉴定所用试剂及缓冲液
    胶回收试剂盒、PCR扩增酶、DNA marker、LB培养基、琼脂糖、琼脂粉,50×TAE电泳缓冲液等。部分试剂具体配制方法列于下方表1、表2。
    表1 5*TBE储存液
    试剂名称    Tris-Base    硼酸     EDTANa2
    用量     54.0g    27.5g    3.72
    蒸馏水溶解定容至1L,核酸电泳配制核酸胶时或作为电泳液使用时稀释100倍
    表2 LB培养基
    试剂名称    Tryptone    Yeast Extract    NaCl
    用量    10g    5g    10g

    蒸馏水溶解定容至1L高压灭菌备用,固体LB,每100 mL液体LB中添加1.2g 琼脂粉,溶解高压灭菌少量置于灭菌平板中冷却凝固备用,如需添加卡那抗性,按照1:1000的比例添加卡那抗性。
    1.1.4  聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂
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