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4.7 pH稳定性 20
5 总结与展望 22
致 谢 23
参考文献 24
1 研究背景
1.1 腈水解酶
1.1.1 腈水解酶简介
早在20世纪30年代，就有人提出用某些植物组织能将腈化物转化成酸的假说来解释一些化学合成的腈化物衍生物对植物生长的促进作用。1964年，Thiman和Mahadevan从大麦叶中分离出来腈水解酶[1]，由于此酶能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶，这是最早的腈水解酶。但是在后来的研究中发现，该纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍[2]。因此Thiman和Mahadevan将其命名为腈水解酶。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然腈化合物蓖麻碱作为唯一碳源筛选得到的假单孢菌(Pseudomonas)，该菌水解氰基吡啶的能力比蓖麻碱高1.18倍[3]。此后，腈水解酶在某些植物、真菌和细菌中也有发现[4]。
腈水解酶被认为是一种可供生物催化选择的很有价值的酶类，它可以在温和的条件下对有机腈类进行转化，其具有的立体选择性和区域选择性可以用来解决在手性催化和区域催化中碰到的问题。腈化合物在自然界中的分布十分广泛而且种类繁多，一些常见的如乙腈、丙烯腈、苯甲腈、苯乙腈、氰酸、氰苷、氰脂、对羟基苯乙腈等。目前，人工合成的和自然界存在的腈类化合物总数已经超过2000种。虽然许多腈化合物具有毒性致畸性以及致癌性，但其在合成胺酰胺羧酸酯类羰基化合物以及杂环化合物中是极其重要的中间体。因此腈水解酶和其他氰基转化酶作为重要的生物催化剂，在有机合成的不同领域具有潜在的应用价值。然而，腈水解酶在技术应用上仍然存在着局限性，例如，酶的活性较低，稳定性较差，底物范围不适合，以及非酶反应等。虽然现在已经有很多报道腈水解酶应用于工业生产中，但在催化过程中的条件仍然有待优化，以适应工业生产的需求。
1.1.2 腈水解酶作用机制
在化学反应中，腈是一类重要的化合物，腈类化合物在酸性或碱性水溶液中加热，即水解生成羧酸，这个反应被广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。腈的化学水解往往需要强酸( 或强碱) 、高温、高压等反应条件，而且副产物多、产量低、环境污染严重，而大大地限制了它在工业上的应用[5]。与化学法相比，生物催化反应是温和的，对环境是无害的，所以生物催化的方法的应用在最近几年得到了相当的重视[6]。现有的研究表明腈的酶法水解具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济型和绿色化学的发展方向，有着化学方法无可比拟的优越。
目前已知氰基化合物的酶水解途径有两条： 一是通过腈水解酶将氰基化合物直接转化成羧酸；二是先通过腈水合酶转化成酰胺，再通过酰胺酶的作用转化成羧酸。通常所说的广义的氰基水解酶即包括这两种途径所涉及的三种酶。两种酶的反应途径见图1[7]。
图1氰基水解酶的反应机理。a）腈水解酶；b）腈水合酶
1.1.3 腈水解酶的应用
（1）二腈选择性水解
对于用化学方法很难实现的二腈的选择性水解，酶法可以很容易完成该反应,甚至对于有一定难度的含有氰基的羧酸的合成，酶法也能轻松实现[8]。1991年，Yamamoto[9]等人首次报道以Alcaligenes faecalis ATCC8750为催化剂，催化外消旋扁桃腈，得到扁桃腈和苯甲醛，对映体过量值（e.e）达到100%，实现了立体选择性，该法已经成功应用与工业化生产R型扁桃酸。Acidovorax facilis全细胞中腈水合酶(半衰期22.7 h，55 ℃)可用于区域选择水合2-甲基戊二腈、2-亚甲基戊二腈、2-乙基琥珀腈、丙二腈、琥珀腈和戊二腈。50 ℃热处理后的Acidovorax facilis全细胞可以使腈水合酶失活，而细胞中腈水解酶可以水解二腈生成二羧酸单酰胺和二羧酸。DeSantis等运用新型的DNA shuffling技术筛选到的多种腈水解酶，如3-羟基戊二腈可分别用不同立体选择性的腈水解酶催化水解，S-型产物和R-型产物的e.e均大于95%，而且产率高达98%。酶的立体选择性是酶催化反应的一大优势，通过具有立体专一性的酶催化可以获得对应异构体过量值(e.e值) 较高的产物，是当今生物催化的研究热点。在腈水解酶立体选择催化研究方面具有代表性的有扁桃腈等α位取代的苯乙腈类化合物的水解，其产物为光学纯羧酸。腈水解酶还可表现出区域选择性，主要表现在多腈化合物中只催化特定部位的氰基。例如，2006年Tao Jun-hua等发表的利用腈水解酶水解异丁基琥珀腈生成3-氰基5-甲基己酸，反应过程中只有距离甲基较远的氰基被水解。腈水解酶还具有化学选择性，是指腈水解酶只水解氰基，对其他可发生水解反应的基团如醚键酯键等不起作用。有人利用腈水解酶将苯甲酰氧基4-氰基丁酸甲酯转化为3-苯甲酰氧基戊二酸单甲酯，此水解反应发生在氰基上，而对2个酯键无影响。