因此，缓冲液侧的药物浓度是游离药物在膜的血清侧的反映。该方法通常用作针对其他方法的参考技术，例如超滤，其中药物与过滤膜和其它表面的非特异性结合可以引起实验假象。        

在进行实验时，将血浆（0.5-1.0mL）加入到具有1mL最大容量的平衡透析细胞中。（由具有10,000Da的MWCO的天然纤维素制成）。使用平衡透析器（Spectra / Por1平衡透析器）在37℃下对血浆腔室中的血浆腔室进行透析以对抗葡萄球菌磷酸盐缓冲液（67mM，pH 7.4）或磷酸盐缓冲盐水。测试药物被加到血浆侧或缓冲区侧或两侧等量[22]。等式（4）适用于测试药物只加在血浆侧的情况。

若渗透水的平衡透析中出现了血浆腔室中的蛋白质变稀释以及半透膜的渗透区体积下降，即称为体积变化。如果对于体积变化（15%-20%）不修正，然后自由与结合药物的浓度以及非线性结合情况的游离部分会降低原始血浆或血清中蛋白质与药物浓度。体积变化可以通过比较最初的血浆浓度与透析后的血浆浓度来复核。据报道，在短时间内（例如4,5个小时），平衡透析导致的体积变化不明显。为了克服体积变化这个问题，可添加高分子量（40000）的葡萄糖（5% w/v）至缓冲腔室中，同时通过做平行实验测试药物与葡萄糖的结合可能性。如果线性结合没有体积变化的干扰，等式（4）可以用来计算结合率。文献综述述xxffyy

    其中Fu是游离分数，Cp是透析前血浆中的药物浓度，，Cf是平衡透析中缓冲腔室中的游离药物浓度，R=缓冲区浓度/血浆浓度，都是在透析前。

在进行平衡透析时，必须注意的一些误区是：（i）37℃时的药物稳定性，平衡透析达到平衡的时间较长。因此，在实验条件下的药物稳定性必须得到确定；（ii）一些药物可能在平衡透析过程中与血浆蛋白发生沉淀。最近，一种高通量平衡透析法由Amika（哥伦比亚，MD）研究出来，该方法是使用10kDa的超薄半透膜96孔径的动态平衡生物透析器。这种方法看起来有前途。

    已经介绍过一种快速平衡透析装置[23]，该装置需要一段较短的准备和透析时间，能够自动化进行高通量的蛋白结合率的测定实验。因为膜的表面积与体积比较高，这可以允许快速透析，可以在四小时内以高再生性与高精度达到平衡。孵化时间可以通过适当的搅拌缩短至100分钟。该方法在溶液中进行，血浆和缓冲液的pH和离子强度保持相对恒定，这可以反映体内的情况，结果可靠，经常用作经典参考方法。

平衡透析也有缺点，就是耗时比较长，通常为12〜48小时。半透膜和蛋白质容易产生体积迁移效应，Gibbs-Donna 效应对带电蛋白的影响和对非特异性透析装配表面的药物吸附作用。目前商用的96孔平衡透析配置用于测定血浆蛋白结合率，其降低非特异性透析设备表面上的药物吸附并加快待测样品的消融，缩短平衡时间，并增加样品的生产量。  

此外，平衡透析结合电化学发光，荧光和质谱等高灵敏度检测方法已被应用于血浆蛋白结合率的测定。

（3） 超速离心法

超离心法的基础机理是凭据液体介质中小分子和蛋白质的沉降速率或密度，在一定离心力场的作用下分离液体介质中的有差别分子的方法。在测定药物蛋白质的结合速率时，蛋白质结合药物形成沉淀物，并且在离心管的上清液中定量测定游离药物小分子。这种技术避免了非特异性膜结合[24]。简单地说，50微升四种浓度的测试药物（0，0.1，0.5，2.5μg/mL）添加至人类血浆中（10ml）。搅拌后，每种血浆样品（重复的）转移至贝克曼指封管聚异质同晶体超速离心管（10ml），然后受到离心分离24小时在37℃，100000g。超速离心前应检查在相同条件下的血浆中的药物稳定性。旋转前血浆和等离子体水中的初始药物浓度应分别确定作为“总血浆”和“总游离”药物浓度。离心分离后，血浆分成明显的三层[25]：固态蛋白质颗粒（最下层）；水层（中间层）；脂肪蛋白层（乳糜微滴）（最上层）。每一层被单独转移至独立离心管来分析鉴定。粘在底部的蛋白质颗粒应使用适当的溶剂来完全溶解。每一层中的药物应当提取出来，如果需要的话，在分析前用固相萃取法或液体萃取法。假定水层中发现的药物含量表示药物的游离分数，反之，脂质和蛋白质层的总和表示药物的结合分数。