2。3 实验仪器

超级洁净工作台购自博讯实业有限公司医疗设备厂；T1-SM120型倒置显微镜购自Nikon公司；高压灭菌器购自美国Zealway公司；AUY220电子分析天平（SHIMADZU CORPATION JAPAN）；752型紫外可见分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司；酶联免疫检测仪购自Biorad公司；HF151二氧化碳培养箱购自力康发展有限公司； AFZ-1001-U艾科浦超纯水系统购自上海百特科技有限公司；PHB-4酸度计购自上海虹益仪器仪表有限公司；ZEISS HAL 100荧光显微镜购自德国Leica公司。

2。4 实验方法

2。4。1 CNE-2细胞培养

CNE-2细胞贴壁培养于含10% 灭活胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件的细胞培养箱中培养。当细胞贴壁生长到铺满培养容器底部90%以上，进行细胞传代。细胞传代以PBS洗涤细胞，0。25% 胰蛋白酶消化细胞，2-3天传代一次， 细胞传代7次内取对数生长期且状态良好的细胞进行实验。即细胞传代后，当细胞贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右，加入不同浓度的NO供体GSNO（每次临用前用RPMI-1640溶液稀释,0。22um过滤除菌)进行作用。

2。4。2 GSNO的合成与定量

2。4。2。1 合成

GSNO不稳定，合成过程避光条件下进行，一般采取现配现用的方式，参考文献[18]，采用GSH和NaNO2在酸性条件下反应的方法合成。

400 mmol/L GSH 0。4 mL，加入0。2 mol/L HCL 0。2 mL，然后加入400 mmol/L NaNO2 0。2 mL，混合室温反应15 min，加入40% NaOH（约3-4 μL), 调整pH=7。2，避光保存于冰浴上。

2。4。2。2 定量

利用分光光度计定量。以蒸馏水调零，将合成的产物稀释200倍后，测定在334 nm处的吸光度值。所得的吸光度值与摩尔吸光系数0。767相比，然后乘以稀释倍数，即求得合成的GSNO的浓度。

2。4。3 MTT实验

收集对数生长期的细胞接种于96孔培养板中，每孔含1。0×104个细胞。培养过夜后，分别用50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L GSNO处理12h、24h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，37℃，5%CO2 及饱和湿度的条件下继续培养4h，每孔加入MTT裂解液 (10%SDS，5%异丁醇，0。012mmol/L HCL)100μL，37℃，5%CO2及饱和湿度的条件下放置过夜后，用Biorad酶标仪在570nm波长处测量各孔吸收值，调零孔则用RPMI-1640代替细胞悬液和药液。每次实验3个复孔，独立实验重复3次。细胞生长抑制率按下列公式计算：文献综述

细胞生长抑制率%=（1－ 实验组平均OD值 )×100%

对照组平均OD值

    进行NO干预试剂N一乙酰半胱氨酸（NAC）5mmol/L（NAC用RPMI-1640溶液溶解稀释）对GSNO作用的影响检测时，传代细胞贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右，预先加入干扰试剂NAC，37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下孵育30min，再加入GSNO（200μmol/L）继续培养24h，再用MTT法检测对细胞增殖的影响。

2。4。4 形态学观察

2。4。4。1 倒置显微镜观察：

将盖玻片用75%乙醇浸泡后，PBS冲洗2遍，10%胎牛血清的RPMI-1640培养液冲洗一遍后，放置于6孔板中。收集对数生长期CNE-2细胞接种于6孔培养板中，每孔含4×105个细胞。培养过夜，待贴壁生长到铺满培养容器底部80%左右后，200μmol/L GSNO 作用12h，对照组加入同体积的RPMI-1640培养液。小心地取出细胞爬片置于载玻片上，置倒置显微镜下观察，照相并记录实验结果。